李俊平，姜明章，馮景輝，孫大勇

(煙臺大洋制藥有限公司，山東 煙臺 265500)

秦川通痹顆粒(3 g/袋)是由秦川通痹片改變劑型而來，秦川通痹片(0.3 g/片)收載于國家藥品監(jiān)督管理局·國家中成藥標(biāo)準(zhǔn)匯編經(jīng)絡(luò)肢體腦系分冊中［標(biāo)準(zhǔn)號:WS－10318(ZD－0318)－2002］。秦川通痹顆粒由秦艽、川芎、威靈仙、桂枝、獨(dú)活、木瓜、黃芪、干姜、牛膝、當(dāng)歸、蒼術(shù)、甘草十二味中藥材制備而成，具有祛風(fēng)除濕、通絡(luò)止痛的功效。用于風(fēng)寒濕痹所致的肢體疼痛、麻木拘攣。為保證本制劑的療效，控制制劑的質(zhì)量，對其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了研究。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 UV－1700型紫外分光光度計(島津(香港)有限公司);島津LC－10AT高效液相譜議，SPD－10A檢測器，Phenomenex ODS C18色譜柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm)。

1.2 試藥 秦川通痹顆粒(本廠自制，批號:070108，070109，070110)，硅膠G(青島海洋化工廠);甲醇(USA色譜純);龍膽苦苷對照品(批號:110770—200308，供含量測定用)、齊墩果酸對照品(批號:110709－200304)、黃芪甲苷對照品(批號:110781－200311)、川芎對照藥材(批號:120918－200406)、甘草對照藥材(批號:120904－200410)、當(dāng)歸對照藥材(批號:120927－200411)，以上對照品、對照藥材均由中國藥品生物制品檢定所提供。其余試劑均為分析純。

2 實(shí)驗內(nèi)容

2.1 鑒別研究

2.1.1 當(dāng)歸、川芎的鑒別 取本品15 g，研細(xì)，加乙醚60 mL，加熱回流1 h，濾過，濾液揮干，殘渣加乙酸乙酯2 mL使溶解，作為供試品溶液。另按本標(biāo)準(zhǔn)的處方量及制法制備缺當(dāng)歸、川芎的陰性對照樣品，按上述供試品溶液制備方法制備陰性對照溶液。另取川芎、當(dāng)歸對照藥材各1 g，同法制成對照藥材溶液。照薄層色譜法(《中國藥典》2005年版一部附錄Ⅵ B)試驗，吸取上述4種溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以正己烷－乙酸乙酯(9∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。陰性對照溶液在相應(yīng)的位置無此斑點(diǎn)，證明陰性無干擾，見圖1。

圖1 當(dāng)歸、川芎的鑒別

2.1.2 黃芪的鑒別 取本品30 g，研細(xì)，加甲醇100 mL，加熱回流1 h，濾過，濾液蒸干，殘渣加水30 mL使溶解，用水飽和正丁醇振搖提取2次，每次20 mL，合并正丁醇液，用10%氫氧化鈉溶液洗滌2次，每次20 mL，棄去堿液，再用正丁醇飽和水洗滌2次，每次30 mL，棄去水液，正丁醇液蒸干，殘渣加甲醇0.5 mL使溶解，作為供試品溶液。另按本標(biāo)準(zhǔn)的處方量及制法制備缺黃芪的陰性對照樣品，按上述供試品溶液制備方法制備陰性對照溶液。另取黃芪甲苷對照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法(《中國藥典》2005年版一部附錄Ⅵ B)試驗，吸取上述三種溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷－甲醇－水(13∶7∶2)的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。分別置日光及紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，日光下顯相同的棕褐色斑點(diǎn);紫外光燈下顯相同的橙黃色熒光斑點(diǎn)。陰性對照溶液在相應(yīng)的位置無此斑點(diǎn)，證明陰性無干擾。見圖2。

圖2 黃芪的鑒別

2.1.3 齊墩果酸的鑒別 取本品40 g，研細(xì)，加乙醇100 mL，加熱回流1 h，濾過，加鹽酸4 mL，加熱回流1 h，濾過，濾液濃縮至約5 mL，加水15 mL，用三氯甲烷振搖提取2次，每次20 mL，分取三氯甲烷液，蒸干，殘渣加乙醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。另按本標(biāo)準(zhǔn)的處方量及制法制備缺威靈仙、木瓜、牛膝的陰性對照樣品，按上述供試品溶液制備方法制備陰性對照溶液。另取齊墩果酸對照品，加乙醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法(《中國藥典》2005年版一部附錄Ⅵ B)試驗，吸取上述三種溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以正己烷－丙酮(2∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，分別置日光及紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，分別顯相同的紫紅色斑點(diǎn)或相同顏色的熒光斑點(diǎn)。陰性對照溶液在相應(yīng)的位置無此斑點(diǎn)，證明陰性無干擾。見圖3。

圖3 齊墩果酸的鑒別

2.1.4 甘草的鑒別 取本品20 g，研細(xì)，加乙醚100 mL，加熱回流2 h，濾過，棄去乙醚液，藥渣揮干，加甲醇50mL，加熱回流1 h，濾過，濾液蒸干，殘渣加水30 mL使溶解，用水飽和正丁醇振搖提取2次，每次20 mL，合并正丁醇液，用正丁醇飽和水洗3次，每次20 mL，棄去水洗液，正丁醇液蒸干，殘渣加甲醇2 mL使溶解，加活性炭少許，搖勻，放置30 min，濾過，濾液濃縮至約1 mL，作為供試品溶液。另按本標(biāo)準(zhǔn)的處方量及制法制備缺甘草的陰性對照樣品，按上述供試品溶液制備方法制備陰性對照溶液。另取甘草對照藥材1 g，同法制成對照藥材溶液。照薄層色譜法(《中國藥典》2005年版一部附錄ⅥB)試驗，吸取上述三種溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一以1%氫氧化鈉溶液制備的硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯 － 甲酸 － 冰醋酸 － 水(15∶1∶1∶2)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的橙黃色熒光斑點(diǎn)。陰性對照溶液在相應(yīng)的位置無此斑點(diǎn)，證明陰性無干擾。見圖4。

2.2 龍膽苦苷含量測定 本品由秦艽、川芎、威靈仙、桂枝、獨(dú)活、木瓜、炙黃芪、干姜、牛膝、當(dāng)歸、蒼術(shù)、甘草十二味中藥組成，具有祛風(fēng)除濕，通絡(luò)止痛的功效。用于風(fēng)寒濕痹所致的肢體疼痛，麻木拘攣。秦艽為本品君藥，其主要有效成分為龍膽苦苷，所以選擇以龍膽苦苷的含量為指標(biāo)對本品質(zhì)量進(jìn)行控制。原秦川通痹片標(biāo)準(zhǔn)中采用薄層掃描法測定其含量，考慮到薄層掃描法的局限性，建立了高效液相色譜法測定龍膽苦苷含量的方法，試驗證明該方法準(zhǔn)確度、精密度高，重現(xiàn)性好，可用來控制本品的質(zhì)量。

色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;以甲醇－水(30∶70)為流動相;檢測波長為254nm。理論板數(shù)按龍膽苦苷峰計算應(yīng)不低于3000。

對照品溶液的制備 精密稱取龍膽苦苷對照品適量，加甲醇制成每1 mL含0.1 mg的溶液，即得。

圖4 甘草的鑒別

供試品溶液的制備 取裝量差異項下的本品，研細(xì)，取3 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，稱定重量，加熱回流30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

測定法 分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測定，即得。

2.2.1 線性關(guān)系的考察 取龍膽苦苷對照品適量，精密稱定為9.05 mg，置25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得濃度為362 μg·mL－1的龍膽苦苷對照品母液。精密量取龍膽苦苷對照品母液1 mL、2 mL、3 mL、5 mL，分置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，得不同濃度的龍膽苦苷對照品溶液(36.2 μg·mL－1、72.4 μg·mL－1、108.6 μg·mL－1、181 μg·mL－1)。精密吸取各濃度的對照品溶液及對照品母液各10 μL，注入液相色譜儀，記錄峰面積，結(jié)果見表1。

表1 龍膽苦苷的線性考察結(jié)果

以峰面積積分值Y為縱坐標(biāo)，龍膽苦苷對照品的進(jìn)樣量X為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖5。

圖5 龍膽苦苷線性關(guān)系圖

對以上結(jié)果進(jìn)行回歸分析，得回歸方程為Y=1.5E+06X － 2.3E+5，r=0.9996，表明龍膽苦苷對照品進(jìn)樣量在0.362～3.62 μg(36.2～362 μg·mL－1)之間與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.2.2 精密度試驗 精密吸取同一龍膽苦苷對照品溶液(濃度 139.2 μg·mL－1)10 μL 注入液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣 6次，記錄色譜圖及峰面積，結(jié)果如表2。

表2 精密度試驗結(jié)果

2.2.3 溶液穩(wěn)定性試驗 精密吸取同一批號的供試品溶液(批號 070108)各 10 μL，分別于 0、2、4、6、8、12 h 進(jìn)樣，記錄色譜圖及峰面積，結(jié)果如表3。

表3 穩(wěn)定性試驗結(jié)果(n=6)

2.2.4 重現(xiàn)性試驗 取批號為070108的本品，按2.2項下方法制備6份供試品溶液，測定其含量，結(jié)果如表4。

表4 重現(xiàn)性試驗(n=6)

2.2.5 加樣回收率試驗 取批號為070108的本品(含量7.65 mg/袋)1.5 g，精密稱定，平行6份，分別精密加入龍膽苦苷對照品溶液(濃度0.161 mg·mL－1)15 mL，按供試品溶液的制備方法制備樣品溶液，測定其含量，按下式計算回收率，結(jié)果見表5。

表5 加樣回收率試驗結(jié)果

由上表可知龍膽苦苷平均回收率為100.52%，RSD為0.87%，證明該方法準(zhǔn)確度高。

2.2.6 含量測定結(jié)果 取批號為070108、070109、070110的本品按供試品溶液的制備方法制備樣品溶液，測定其含量，結(jié)果見表6。

表6 含量測定結(jié)果

3 結(jié)論

由當(dāng)歸、川芎、黃芪、齊墩果酸、甘草鑒別結(jié)果可見，結(jié)果分離度好、斑點(diǎn)清晰、重現(xiàn)性好，且陰性樣品無干擾，具有專屬性。由龍膽苦苷含量測定方法考察結(jié)果可見，本法精密度高，重現(xiàn)性及線性關(guān)系好，回收率高，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。本研究可控制該制劑質(zhì)量。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典2005年版，(一部)［S］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2005.

［2］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典中藥材薄層色譜彩色圖集［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，1993.

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