王夢亮，張 婧

（山西大學(xué)應(yīng)用化學(xué)研究所，山西太原030006）

大豆是我國主要的糧食和油料作物，同時(shí)也是重要的飼料作物，但是，近年來我國大豆呈現(xiàn)出產(chǎn)量低、品質(zhì)差的特點(diǎn)，我國從大豆的凈出口國變成了大豆的凈進(jìn)口國[1]。山西省耕地面積少、耕地質(zhì)量差，同時(shí)人口眾多，因此，提高大豆的產(chǎn)量和質(zhì)量迫在眉睫。近年來，山西省對于大豆的研究有了較大的發(fā)展，并且發(fā)現(xiàn)山西省土壤中99.4%以上的根瘤菌為費(fèi)氏中華根瘤菌[2]。對此，山西大學(xué)應(yīng)用化學(xué)研究所經(jīng)過幾年的努力，利用植物仿生學(xué)原理，研制出了一種大豆根瘤促生劑，經(jīng)過3 a大面積田間試驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)，在底肥中添加大豆根瘤促生劑后，可以使大豆產(chǎn)量提高30%～50%，中期取樣時(shí)發(fā)現(xiàn)，施加后的大豆植物體根部產(chǎn)生的根瘤明顯多于未施加的，且多為有效瘤。大量的研究也表明，大豆結(jié)瘤受很多外在因素的影響[3-4]。

結(jié)瘤因子作為豆科植物結(jié)瘤過程中的信號分子，在豆科植物結(jié)瘤和根瘤菌的專一性方面起著舉足輕重的作用，它是根瘤菌在根系分泌物（主要為類黃酮類物質(zhì)）的誘導(dǎo)下產(chǎn)生的一種脂寡糖類化合物[5-6]。同一根瘤菌在不同誘導(dǎo)劑的作用下產(chǎn)生的結(jié)瘤因子的種類和數(shù)量均不同[7]。侯衛(wèi)國等[7-8]均用高效液相色譜對結(jié)瘤因子進(jìn)行了檢測，所用的檢測器均為紫外檢測器，但此方法比較復(fù)雜，因此，本研究中決定以合適的誘導(dǎo)劑對根瘤菌培養(yǎng)液進(jìn)行誘導(dǎo)后，以紫外分光光度計(jì)對結(jié)瘤因子進(jìn)行檢測[9]。

本研究通過大豆根瘤促生劑對費(fèi)氏中華根瘤菌產(chǎn)結(jié)瘤因子的影響，初步確定大豆根瘤促生劑的作用機(jī)理，進(jìn)而使大豆根瘤促生劑可以更好地應(yīng)用于大豆生產(chǎn)中。

1 材料和方法

1.1 材料

費(fèi)氏中華根瘤菌，購自中國科學(xué)院微生物研究所。晉豆25號，由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所提供。大豆根瘤促生劑、752型紫外分光光度計(jì)，由山西大學(xué)應(yīng)用化學(xué)研究所提供。染料木黃酮，購自sigma公司。

培養(yǎng)基（1000mL）：葡萄糖15g，K2HPO40.39g，（NH4）2SO41.5 g，KH2PO40.61 g，MgSO40.6 g，豆芽200 g，瓊脂 15～20 g，NaCl0.1 g，pH 值 7.0（液體培養(yǎng)時(shí)不加瓊脂）。

1.2 方法

1.2.1 大豆根瘤促生劑對費(fèi)氏中華根瘤菌生長的影響 向50mL液體培養(yǎng)基中加入費(fèi)氏中華根瘤菌進(jìn)行搖床培養(yǎng)，培養(yǎng)2 d后得到種子液。向50mL液體培養(yǎng)基中加入0.5mL種子液和0.05mL大豆根瘤促生劑進(jìn)行培養(yǎng)，每1 h取樣1次，于600 nm處測定吸光度值。每個(gè)樣品取3個(gè)重復(fù)求平均值，以菌體培養(yǎng)基為對照，分別繪制添加根瘤促生劑和不添加根瘤促生劑菌體的生長曲線。同時(shí)采用平板菌落計(jì)數(shù)法對施用過根瘤促生劑的田間土壤樣品中的根瘤菌進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.2.2 費(fèi)氏中華根瘤菌產(chǎn)結(jié)瘤因子檢測波長的確定 （1）結(jié)瘤因子的誘導(dǎo)：向培養(yǎng)至對數(shù)期的菌液中加入0.1%的染料木黃酮后繼續(xù)培養(yǎng)2 d。（2）結(jié)瘤因子的提取：將培養(yǎng)液在10 000 r/min下離心30min，取上清液；用1/4體積的正丁醇抽提上清液3次，取正丁醇相；減壓蒸發(fā)去有機(jī)相，以雙蒸水溶解剩余物；以等體積乙酸乙酯洗滌3次，取水相。（3）結(jié)瘤因子檢測波長的確定：將處理過的添加染料木黃酮的培養(yǎng)液（以處理過的不加染料木黃酮培養(yǎng)液為空白對照）進(jìn)行全波長掃描后，即可得到費(fèi)氏中華根瘤菌結(jié)瘤因子的檢測波長。

1.2.3 大豆根瘤促生劑對費(fèi)氏中華根瘤菌產(chǎn)結(jié)瘤因子的影響 根系研磨物的制備：大豆水培5 d后選取數(shù)顆，剪下根部，加10mL無菌水和少量石英砂在研缽中進(jìn)行研磨，研磨均勻后用濾紙進(jìn)行過濾，得到的濾液用0.22μm濾膜過濾后冷藏備用。

分別向培養(yǎng)至對數(shù)期的菌液中加入0.1%大豆根瘤促生劑、0.1%的根研磨液、0.1%大豆根瘤促生劑＋0.1%的根研磨液，于1.2.2確定的檢測波長處進(jìn)行比對。

1.2.4 大豆根瘤促生劑作用下費(fèi)氏中華根瘤菌產(chǎn)結(jié)瘤因子培養(yǎng)條件的優(yōu)化

1.2.4.1 培養(yǎng)基對費(fèi)氏中華根瘤菌產(chǎn)結(jié)瘤因子的影響 分別以市售綠豆芽、黃豆芽及實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的黃豆芽配制培養(yǎng)基，在培養(yǎng)至對數(shù)期時(shí)分別向3種不同的培養(yǎng)基中加入0.1%的根研磨液后再培養(yǎng)2 d，誘導(dǎo)處理后于1.2.2確定的檢測波長處進(jìn)行比對，結(jié)瘤因子的誘導(dǎo)方法同1.2.2。

1.2.4.2 誘導(dǎo)劑對費(fèi)氏中華根瘤菌產(chǎn)結(jié)瘤因子的影響 將菌液培養(yǎng)至對數(shù)期時(shí)分別加入0.1%全豆芽研磨液＋0.1%大豆根瘤促生劑、0.1%全豆芽研磨液、0.1%大豆根瘤促生劑、0.1%根研磨液，繼續(xù)培養(yǎng)2 d，進(jìn)行誘導(dǎo)處理后，于1.2.2確定的檢測波長處進(jìn)行比對。

1.2.4.3 誘導(dǎo)劑用量對費(fèi)氏中華根瘤菌產(chǎn)結(jié)瘤因子的影響 分別向培養(yǎng)至對數(shù)期的菌液中加入 0.1%，0.5%，1.0%，1.5%，2.0%由 1.2.4.2確定的誘導(dǎo)劑培養(yǎng)2 d，誘導(dǎo)處理后于確定的波長處進(jìn)行比對。

1.2.4.4 溫度對費(fèi)氏中華根瘤菌產(chǎn)結(jié)瘤因子的影響 將培養(yǎng)至對數(shù)期的費(fèi)氏中華根瘤菌置于10，15，20，25，30，35，40，45，50 ℃下培養(yǎng)，2 d 后處理，于1.2.2確定的檢測波長處進(jìn)行比對。

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆根瘤促生劑對費(fèi)氏中華根瘤菌生長的影響

2.1.1 實(shí)驗(yàn)室條件下大豆根瘤促生劑對費(fèi)氏中華根瘤菌生長的影響 通過添加大豆根瘤促生劑和未添加過的取樣后繪制出的菌體生長曲線（圖1）可以看出，添加大豆根瘤促生劑后，費(fèi)氏中華根瘤菌的對數(shù)期提前，穩(wěn)定期持續(xù)時(shí)間延長，且在相同的培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，添加大豆根瘤促生劑的培養(yǎng)液中的菌體濃度明顯高于對照組。

2.1.2 大豆根瘤促生劑對土壤中費(fèi)氏中華根瘤菌生長的影響 從表1可以看出，添加過不同用量大豆根瘤促生劑的土壤中費(fèi)氏中華根瘤菌的數(shù)量明顯高于對照組，且大豆根瘤促生劑的用量越大，費(fèi)氏中華根瘤菌的數(shù)量越多。

表1 大豆根瘤促生劑對土壤中費(fèi)氏中華根瘤菌生長的影響

2.2 費(fèi)氏中華根瘤菌產(chǎn)結(jié)瘤因子檢測波長確定

將添加過染料木黃酮的費(fèi)氏中華根瘤菌菌液處理后（以未添加過任何誘導(dǎo)劑的菌液（進(jìn)行相同的誘導(dǎo)處理）為空白對照）進(jìn)行全波長掃描，得出費(fèi)氏中華根瘤菌產(chǎn)生的結(jié)瘤因子在218 nm處具有吸收峰，即費(fèi)氏中華根瘤菌產(chǎn)生的結(jié)瘤因子的檢測波長為218 nm。

2.3 大豆根瘤促生劑對費(fèi)氏中華根瘤菌產(chǎn)結(jié)瘤因子的影響

由圖2可知，未添加任何誘導(dǎo)劑的菌液中結(jié)瘤因子的OD218為0.018，加入0.1%大豆根瘤促生劑的菌液中結(jié)瘤因子的OD218為0.479，加入0.1%根研磨液的菌液中結(jié)瘤因子的OD218為0.510。同時(shí)，添加0.1%大豆根瘤促生劑和0.1%根研磨液的菌液中產(chǎn)生的結(jié)瘤因子的OD218為0.798。可以得出，大豆根瘤促生劑可以誘導(dǎo)費(fèi)氏中華根瘤菌產(chǎn)生結(jié)瘤因子，且大豆根瘤促生劑與根系研磨液對費(fèi)氏中華根瘤菌產(chǎn)結(jié)瘤因子具有相同的作用效果。

2.4 在大豆根瘤促生劑作用下，費(fèi)氏中華根瘤菌產(chǎn)結(jié)瘤因子培養(yǎng)條件的優(yōu)化

2.4.1 不同培養(yǎng)基對費(fèi)氏中華根瘤菌產(chǎn)結(jié)瘤因子的影響 從圖3可以看出，市售綠豆芽配制的培養(yǎng)基產(chǎn)生的結(jié)瘤因子的OD218為0.325，市售黃豆芽配制的培養(yǎng)基產(chǎn)生的結(jié)瘤因子的OD218為0.413，實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的黃豆芽配制的培養(yǎng)基產(chǎn)生的結(jié)瘤因子的OD218為0.525。這可能是因?yàn)椋海?）綠豆中含有抑菌成分；（2）市售黃豆芽中大部分是添加過尿素的，在制作培養(yǎng)基的過程中并不能完全清除沾染在豆芽上的尿素，而尿素對根瘤菌的生長可能有一定的影響。

2.4.2 不同誘導(dǎo)劑對費(fèi)氏中華根瘤菌產(chǎn)結(jié)瘤因子的影響 從表2可以看出，以不同誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)產(chǎn)生的結(jié)瘤因子的量不同，從多到少依次為：0.1%全豆芽研磨液＋0.1%大豆根瘤促生劑、0.1%全豆芽研磨液、0.1%根研磨液、0.1%大豆根瘤促生劑。由于全豆芽研磨液中含有的類黃酮類物質(zhì)多于豆芽根研磨液，所以全豆芽研磨液可以誘導(dǎo)產(chǎn)生更多的結(jié)瘤因子。

表2 誘導(dǎo)劑對費(fèi)氏中華根瘤菌產(chǎn)結(jié)瘤因子的影響

2.4.3 誘導(dǎo)劑用量對費(fèi)氏中華根瘤菌產(chǎn)結(jié)瘤因子的影響 從圖4可以看出，雖然隨著誘導(dǎo)劑用量的增加，費(fèi)氏中華根瘤菌產(chǎn)生的結(jié)瘤因子的量也在增加，但是，從1.0%開始，結(jié)瘤因子量的漲幅變小，從經(jīng)濟(jì)和實(shí)用的角度考慮，選用1.0%的誘導(dǎo)劑比較合理。而造成這一情況的原因是在相同的培養(yǎng)環(huán)境中可以存在的根瘤菌數(shù)是動(dòng)態(tài)平衡的，所以可以利用的誘導(dǎo)劑用量是一定的，過多的誘導(dǎo)劑反而會(huì)造成浪費(fèi)。

2.4.4 溫度對費(fèi)氏中華根瘤菌產(chǎn)結(jié)瘤因子的影響 由圖5可知，隨著溫度的升高，費(fèi)氏中華根瘤菌產(chǎn)生的結(jié)瘤因子的濃度逐漸增加；但30℃以后，隨著溫度的升高，結(jié)瘤因子的濃度逐漸減小。這可能是因?yàn)椋Y(jié)瘤因子的產(chǎn)生與酶的作用有關(guān)，隨著溫度的升高，酶的活性逐漸提高；但過高的溫度可能會(huì)使酶失活，從而導(dǎo)致根瘤菌產(chǎn)生的結(jié)瘤因子的量減少。同時(shí)，30℃時(shí)菌體活力較高，也可能會(huì)促進(jìn)根瘤菌產(chǎn)生和分泌結(jié)瘤因子。

3 結(jié)論

本研究得出，大豆根瘤促生劑不僅可以促進(jìn)費(fèi)氏中華根瘤菌的生長，而且可以在一定程度上誘導(dǎo)費(fèi)氏中華根瘤菌產(chǎn)生結(jié)瘤因子；作為大豆結(jié)瘤中的關(guān)鍵因子，結(jié)瘤因子量的增加對大豆結(jié)瘤具有促進(jìn)作用。當(dāng)然，由于一些因素的影響，本試驗(yàn)只進(jìn)行了很小一部分的研究，還不能完全確定該根瘤促生劑的作用機(jī)理。添加大豆根瘤促生劑后對費(fèi)氏中華根瘤菌產(chǎn)生的結(jié)瘤因子的結(jié)構(gòu)是否有影響、根瘤促生劑能否對其他豆科植物或非豆科植物的結(jié)瘤及固氮具有影響等均是以后研究的重點(diǎn)。為使大豆根瘤促生劑更好地應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，還需要進(jìn)行更深入和徹底的研究。

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