貴州師范大學(xué)生命科學(xué)院 孫云子

四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物營養(yǎng)研究所 余 冰 陳代文*

早期斷奶仔豬腸道機(jī)能發(fā)育還不完善，斷奶后日糧的改變，首先使腸道受到損傷。如何通過營養(yǎng)緩解斷奶應(yīng)激對腸道造成的不利影響，成為仔豬飼養(yǎng)的關(guān)鍵。小腸的結(jié)構(gòu)和功能在種屬和不同生命周期的差異是由遺傳因素決定的，但該遺傳因素卻受進(jìn)化過程中日糧（營養(yǎng)）物理形態(tài)、日糧來源、組成以及加工方式的影響（Bikker等，2006）。

斷奶后日糧特點(diǎn)對仔豬小腸結(jié)構(gòu)和各種功能的調(diào)節(jié)起重要作用（Klurfeld，1999；Mathers，1998；Sanderson，1998）。研究表明，斷奶后日糧中蛋白質(zhì)種類對胰腺和十二指腸食糜中胰蛋白酶和糜蛋白酶的分泌有影響。含脫脂奶粉的日糧對斷奶3 d的仔豬胰腺中的胰蛋白酶合成和分泌具有強(qiáng)烈的刺激作用，而大豆?jié)饪s蛋白對斷奶6 d的小腸和胰腺中的胰蛋白酶活性影響最大，在斷奶10 d后，蛋白質(zhì)種類對機(jī)體消化酶的影響作用消失（Makkink 等，1994a、b）。 總之各種蛋白質(zhì)源的比較研究都表明，乳制品對早期斷奶仔豬小腸形態(tài)結(jié)構(gòu)、消化酶活性及機(jī)體機(jī)能的影響最?。◤埡旮?，2000）。因此不同蛋白源對小腸消化生理機(jī)能和結(jié)構(gòu)影響的機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

本研究利用形態(tài)組織學(xué)技術(shù)直接觀察早期斷奶仔豬不同日齡小腸形態(tài)結(jié)構(gòu)及腸上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的差異，以幫助了解不同蛋白源日糧對早期斷奶仔豬小腸發(fā)育過程中結(jié)構(gòu)和功能影響的差異。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動物 選24頭21 d斷奶仔豬，隨機(jī)分成2組，處理1組飼喂乳源蛋白代替30%總蛋白日糧，處理2組飼喂全植物蛋白日糧，每個處理12頭。試驗(yàn)期14 d。

1.2 試驗(yàn)日糧 各個處理基礎(chǔ)日糧原料組成和營養(yǎng)水平參照NRC（1998）體重為5～10 kg豬的營養(yǎng)需要配制，飼糧原料組成及營養(yǎng)水平見表1。其中處理1組使用乳源蛋白代替30%日糧總蛋白日糧組，處理2為全植物蛋白日糧組。

表1 試驗(yàn)日糧組成及營養(yǎng)水平

1.3 樣本采集 分別在斷奶0、3、7 d和14 d清晨各處理屠宰3頭，其中2頭公豬，1頭母豬，采集腸道組織樣品，用于腸道形態(tài)組織學(xué)觀察。樣本采集：分離部分空腸，修剪成大約1 cm長短，用4℃生理鹽水沖洗干凈，放入10%甲醛液固定樣品中，室溫保存。用于細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察組織樣，按照電鏡觀察要求迅速在冰上用刀片將腸組織塊修成大約1 mm×1 mm×1 mm，也可將組織修成1 mm×1 mm×2 mm大小長條形。取材具體操作方法：將取出的空腸組織放在潔凈的石英板上，滴一滴預(yù)冷的固定液，用兩片新的剃須刀片成“拉鋸式”將組織切下并修小，然后用牙簽或鑷子將組織塊移至盛有預(yù)冷的固定液小青瓶中。如果組織帶有較多的污物，先用固定液洗幾遍，然后再切成小塊固定。

1.4 仔豬空腸形態(tài)組織學(xué)觀察 取10%甲醛溶液固定樣品，常規(guī)脫水，石蠟包埋，切片，H.E染色。采用多媒體彩色病理圖像分析儀測量小腸黏膜厚度、隱窩深度和絨毛高度。雙盲法讀片，每張切片觀察5個視野。4%生理鹽水沖洗干凈后放入4%多聚甲醛中固定，修整、脫水、包埋、切片和H.E染色制成切片，采用多媒體彩色病理圖像分析儀測量空腸固有膜厚度、絨毛長度、絨毛寬度、隱窩深度等。雙盲法讀片，每張切片測量5個視野。

1.5 仔豬空腸上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察 樣品在4℃下5%戊二醛中進(jìn)行24 h前固定后，4℃0.1%PBS清洗3次：1%四氧化鋨固定90 min；0.1%PBS清洗3遍； 用50%、70%、80%、90%和100%的丙酮進(jìn)行梯度脫水2次，每次15 min；環(huán)氧樹脂∶丙酮（1∶1）于 37 ℃烘箱聚合 24 h；用包埋劑∶丙酮（3∶1）純浸透2 h后再用包埋劑加DMP-30包埋45℃ 24 h；之后轉(zhuǎn)移到60℃烘箱固化24 h；利用超薄切片機(jī)切厚度為1～10 μm的切片。將切下的片子用鑷子或小毛刷轉(zhuǎn)移到干凈的預(yù)先滴有蒸餾水的載玻片上，加溫，使切片展平，干燥后經(jīng)甲苯胺藍(lán)染色，光學(xué)顯微鏡觀察進(jìn)行半薄切片定位；再于LKB超薄切片機(jī)切500-600A超薄切片；醋酸雙氧鈾，檸檬酸鉛雙重染色，日立H-7650透射電鏡觀察。

1.6 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS’S 13.0對該組數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，Duncan’s法進(jìn)行多重比較，結(jié)果用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，以P＜0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 不同蛋白源日糧組仔豬小腸組織結(jié)構(gòu)和組織學(xué)變化 由表2可看出，與斷奶時（0 d）相比，處理1日糧組在斷奶后3、7 d和14 d的絨毛高度、絨毛寬度和隱窩深度均顯著降低（P＜0.01）。絨毛高度和斷奶時0 d相比，急劇下降，只有斷奶時的43%；斷奶7 d時，大約恢復(fù)到斷奶時的61%；斷奶14 d時，達(dá)到了斷奶時的88%。絨毛寬度在斷奶3 d時也降低到最低，大約只有斷奶時的57%，其后增加并超過斷奶時的寬度。處理1日糧對隱窩深度和固有膜厚度的影響，在斷奶后不同日齡變化模式基本與絨毛高度和絨毛寬度一致，均在斷奶3 d時表現(xiàn)為最低水平。在斷奶7 d時，隱窩深度已經(jīng)加深，固有膜厚度增厚；在斷奶14 d時，已經(jīng)超過斷奶時的深度和厚度，差異極顯著（P ＜ 0.01）。

表2 不同蛋白源日糧對仔豬空腸組織結(jié)構(gòu)的影響

在處理2組中，絨毛高度在從斷奶到斷奶7 d是持續(xù)降低的，在斷奶14 d出現(xiàn)增高的趨式，但是還是顯著低于斷奶時的高度，差異達(dá)到極顯著水平（P＜0.01），只有斷奶時的41%。絨毛寬度和隱窩深度的變化模式與絨毛高度一致，均在斷奶3 d時最低，而后有所恢復(fù)，但遠(yuǎn)未達(dá)到斷奶時的水平，差異極顯著（P＜0.01）。固有膜厚度的變化同樣在斷奶3 d時為最低水平，但其后能夠恢復(fù)并超過斷奶時厚度，差異極顯著（P＜0.01）。與處理1組相比，處理2組顯著降低了空腸絨毛高度、隱窩深度、絨毛寬度（P＜0.01）。

2.2 不同蛋白源日糧對仔豬小腸上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響 對仔豬空腸上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察，在斷奶3 d采食處理1日糧仔豬的吸收細(xì)胞微絨毛的整齊度較好，線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和游離核糖體也很豐富，而采食處理2組日糧的結(jié)構(gòu)已經(jīng)開始發(fā)生比較大的變化，如吸收細(xì)胞微絨毛稀疏、變短、甚至出現(xiàn)脫落，而且部分微絨毛絲心小根不清晰。粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)部分?jǐn)U張病變，線粒體也是同樣狀況。斷奶7 d時，處理1組的吸收細(xì)胞整體微絨毛變短，但程度不一樣，且稀疏，同時可見部分粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，部分發(fā)生了病變，線粒體數(shù)量減少，并可以觀察到極少數(shù)溶酶體的雛形。對應(yīng)的處理2組，空腸上皮吸收細(xì)胞表現(xiàn)微絨毛短而稀疏，并可見微絨毛融合，脫落現(xiàn)象。粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核糖體數(shù)量少，且粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹，并出現(xiàn)壞死的吸收細(xì)胞；斷奶14 d時，采食處理1日糧的仔豬空腸上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)明顯發(fā)生好轉(zhuǎn)變化，主要表現(xiàn)為：線粒體個數(shù)增加，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)變化不大，微絨毛密度增加，但還是可以觀察到溶酶體的初級形態(tài)。處理2日糧組仔豬空腸上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)未見好轉(zhuǎn)，微絨毛嚴(yán)重脫落，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核糖體數(shù)量較少，并大部分發(fā)生病變。

3 討論

3.1 不同蛋白源日糧對小腸組織結(jié)構(gòu)和組織學(xué)變化的影響 斷奶后日糧形態(tài)和組成變化給仔豬小腸的消化酶活性以及形態(tài)組織學(xué)帶來影響（Kiarie 等，2007；Hampson 等，1986）。 一直以來，以豆粕為主的大豆蛋白是飼料中的主要蛋白質(zhì)，但由于含一些抗原性物質(zhì)，如大豆球蛋白、抗胰蛋白酶抑制因子等，而使仔豬小腸易產(chǎn)生暫時性的過敏反應(yīng)，引起仔豬小腸形態(tài)組織結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，如絨毛高度降低、絨毛萎縮等現(xiàn)象。而動物來源的動物蛋白在動物機(jī)體經(jīng)酶解可釋放出許多具有重要生理功能的生物活性肽，能夠刺激小腸細(xì)胞增殖、組織蛋白質(zhì)合成、消化酶成熟，促進(jìn)礦物質(zhì)元素吸收利用，調(diào)節(jié)胃腸運(yùn)動（趙念等，2008；霍永久等，2006）。

斷奶后仔豬的食物由流質(zhì)的母乳轉(zhuǎn)變成固態(tài)飼料，這對仔豬小腸組織來說是一個強(qiáng)烈的刺激。許多研究表明，斷奶后日糧組成的變化使小腸絨毛長度和隱窩深度都造成不同程度的影響（Kim等，2001；Van 等，1998）。 Pluske（1996a、b）等研究表明，仔豬腸壁形態(tài)結(jié)構(gòu)在斷奶前后完全不同，斷奶前小腸黏膜上皮絨毛呈現(xiàn)纖長手指狀，隱窩較淺，斷奶后1周內(nèi)絨毛變?yōu)檩^短的平滑舌狀，隱窩加深。Hampson（1986）報(bào)道，仔豬在斷奶后24 h絨毛高度縮短至斷奶前的75%，并繼續(xù)縮短至斷奶第5天，此時絨毛高度僅為斷奶前的50%。本研究中，斷奶后小腸形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)都發(fā)生了顯著變化。在處理1組中，無論是絨毛高度還是絨毛寬度都發(fā)生了顯著的變化，斷奶3 d時均處于最低水平，差異極顯著（P＜0.01），在斷奶 14 d時，絨毛高度和絨毛寬度又重新恢復(fù)到斷奶時水平；而隱窩深度在斷奶3 d變淺后逐漸變深，在斷奶14 d時達(dá)到最高水平。

在全植物日糧組中，小腸各個形態(tài)組織學(xué)指標(biāo)的變化與處理1組在斷奶3 d時基本一致，但是從后期的恢復(fù)狀態(tài)看來，未能恢復(fù)到斷奶時水平。由于植物蛋白中各種抗?fàn)I養(yǎng)因子的存在，使得斷奶后動物的小腸受到嚴(yán)重?fù)p傷，修復(fù)過程就很緩慢。從各項(xiàng)指標(biāo)看，基本都在斷奶3 d表現(xiàn)最差，之后有所回升，但很緩慢。尤其是絨毛高度在斷奶14 d依然沒有達(dá)到斷奶時水平，差異極顯著。在斷奶14 d，絨毛寬度和隱窩深度有所恢復(fù)，差異不顯著。

本研究結(jié)果表明，處理1組對小腸形態(tài)組織結(jié)構(gòu)的影響程度不深，動物能夠迅速修復(fù)而恢復(fù)并超過到斷奶時的水平。而處理2組對斷奶仔豬小腸的強(qiáng)烈刺激，造成動物自身的調(diào)控修復(fù)能力不能正常發(fā)揮，使小腸組織形態(tài)狀況發(fā)生嚴(yán)重?fù)p傷，并難于修復(fù)。

3.2 不同蛋白源日糧對小腸上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響 斷奶對小腸的形態(tài)組織結(jié)構(gòu)不僅僅是在生長性能上具有重要的影響，對腸上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)也有影響。哺乳階段能夠促進(jìn)腸上皮細(xì)胞的增殖分化(Buccigrossi等，2007)，而斷奶應(yīng)激使小腸的組織結(jié)構(gòu)和功能受到一定程度的不利影響（Nabuur等，1998）。 本研究發(fā)現(xiàn)，仔豬斷奶 3 d和斷奶時相比，處理1組的腸上皮細(xì)胞的微絨毛大部分正常,但變短、變稀、整齊度較好，各種細(xì)胞器總體未出現(xiàn)較大變化。但斷奶7 d時，部分細(xì)胞器發(fā)生了病變，如部分的線粒體和RER水腫，已經(jīng)可以看到溶酶體雛形開始出現(xiàn)，在斷奶14 d時狀況發(fā)生好轉(zhuǎn)，線粒體和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)數(shù)量明顯增加。而處理2組的總體狀況比較嚴(yán)重，如微絨毛變短變稀甚至脫落，線粒體出現(xiàn)腫脹、電子密度明顯下降，甚至空泡，內(nèi)嵴變短甚至消失;粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)出現(xiàn)擴(kuò)張，基質(zhì)透明呈氣球樣等超微結(jié)構(gòu)改變；伴隨線粒體腫脹同時發(fā)生，還可以發(fā)生RER脫顆粒，其表面附著核糖體減少或者稀疏，從而影響細(xì)胞蛋白質(zhì)合成和分泌。

4 結(jié)論

不同蛋白源日糧對腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)有影響，全植物蛋白日糧對腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響較乳源蛋白替代部分總蛋白嚴(yán)重。

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