劉新亮，德 英，趙來喜

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院草原研究所，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010； 2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院，北京 100081)

垂穗披堿草(Elymusnutans)為禾本科(Gramineae)小麥族(Triticeae)披堿草屬(Elymus)多年生疏叢型草本植物，又名鉤頭草、彎穗草[1]，染色體組構(gòu)成為StStYYHH(2n=42)[2]。國外主要分布于俄羅斯、土耳其、印度、蒙古等地，我國主要分布于西北、西南、華北地區(qū)[1]。垂穗披堿草根莖分蘗能力強(qiáng)，具有極強(qiáng)的抗寒性和抗旱性，能適應(yīng)各種不同類型的土壤，灘地、溝谷、陰坡山麓地帶到灌叢草甸和高山草甸均能生長。開花期前垂穗披堿草質(zhì)地柔軟，無刺毛、剛毛，無異味，為馬、牛、羊喜食牧草，整個(gè)生長季節(jié)粗蛋白含量變化幅度較小，屬中上等品質(zhì)牧草[1-6]，同時(shí)也是最具經(jīng)濟(jì)意義的草種[7-8]。簡單序列重復(fù)區(qū)間(inter-simple sequence repeat，ISSR)是Zietkiewicz等[9]于1994年創(chuàng)建的以重復(fù)序列的單一引物為主要引物序列的PCR標(biāo)記，它結(jié)合了SSR和RAPD的優(yōu)點(diǎn)，主要特點(diǎn)是操作簡單，遺傳多態(tài)性高，重復(fù)性好，耗資少，模板DNA用量少。基于這些優(yōu)點(diǎn)，ISSR分子標(biāo)記已廣泛應(yīng)用于牧草種質(zhì)資源鑒定、牧草遺傳多樣性與分類進(jìn)化、DNA指紋圖庫的建立、親緣關(guān)系分析、遺傳圖譜構(gòu)建、分子標(biāo)記輔助育種等方面的研究[10]。ISSR分子標(biāo)記在披堿草屬植物研究中的應(yīng)用多見報(bào)道[11-12]，而其在垂穗披堿草研究中應(yīng)用相對(duì)較少。ISSR分子標(biāo)記反應(yīng)條件易受模板DNA、dNTPs、Mg2+、TaqDNA聚合酶、引物等因素的影響，ISSR擴(kuò)增結(jié)果，若以單因素試驗(yàn)，難免忽視其互作效應(yīng)，而正交試驗(yàn)?zāi)軌蚍治龈饕蛩刂g的內(nèi)在規(guī)律，具有均衡分散、整齊可比和效應(yīng)明確的優(yōu)點(diǎn)，能較快地找到最優(yōu)組合，找出影響擴(kuò)增的主要因素和次要因素[13]。本研究利用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，從模板DNA、dNTPs、Mg2+、TaqDNA聚合酶、引物5個(gè)因素4個(gè)水平，對(duì)垂穗披堿草ISSR-PCR反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化，以期獲得垂穗披堿草的最佳反應(yīng)體系。

1 材料與方法

1.1材料 供試的17份試驗(yàn)材料由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院草原研究所提供(表1)，于2010年5月在溫室育苗，待幼苗長到一定高度，采集嫩葉，置于-80℃保存?zhèn)溆?。參考馬嘯[11]和祁娟[3]所用引物序列，由上海生工生物工程有限公司合成(表2)。PCR所用的dNTPs、Mg2+、TaqDNA聚合酶、10×buffer(不含Mg2+)均購自大連寶生物工程有限公司(TaKaRa)。

1.2方法

1.2.1DNA提取 采用改良過的CTAB法[14]提取基因組DNA，利用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量，利用UNICO公司生產(chǎn)的UN 4802型紫外分光光度計(jì)檢測DNA的濃度和DNA純度，并將質(zhì)量濃度稀釋到30 ng/μL。

表1 試驗(yàn)所用垂穗披堿草材料

表2 試驗(yàn)所采用的引物序列

1.2.2ISSR-PCR反應(yīng)體系的正交優(yōu)化 以UBC822為試驗(yàn)引物，引物序列為(TC)8A，用EN001樣品DNA作為模板，選用L16(45)正交表對(duì)Mg2+、Taq DNA聚合酶、模板DNA、dNTPs、引物5個(gè)因素各4個(gè)水平設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增體系的因素-水平試驗(yàn)(表3)。

表3 ISSR-PCR體系的因素水平

將表4的處理重復(fù)2次，PCR反應(yīng)體系總體積為25 μL，除表4所列變化因素外,每個(gè)組合中還含有10×buffer(不含Mg2+)2.5 μL，用ddH2O補(bǔ)充總體積至25 μL。

表4 ISSR-PCR正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)表

1.2.3PCR擴(kuò)增 PCR擴(kuò)增反應(yīng)是在DNAEngine(PTC-200)PCR儀上進(jìn)行。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性2 min，94℃變性1 min，51℃退火1 min，72℃延伸2 min，共40個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min，擴(kuò)增完后4℃保存[11]，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，DL2000為Marker，在Bio-RAP凝膠成像系統(tǒng)成像。

1.2.4引物退火溫度的確定 在試驗(yàn)最佳反應(yīng)體系確定的基礎(chǔ)上，在DNAEngine(PTC-200)PCR儀上進(jìn)行最佳退火溫度的篩選，從25條引物中篩選出多態(tài)性豐富的引物，根據(jù)理論退火溫度對(duì)每個(gè)引物進(jìn)行退火溫度的梯度試驗(yàn)，設(shè)置8個(gè)梯度：47.7、49.2、51.5、54.4、57.8、60.6、62.8和64.4℃。

1.2.5循環(huán)次數(shù)、延伸時(shí)間的確定 利用最佳反應(yīng)體系和最適退火溫度對(duì)循環(huán)次數(shù)進(jìn)行梯度試驗(yàn)，設(shè)定梯度為：35、37、39、41、43和45次，每個(gè)梯度2個(gè)重復(fù)；利用最佳反應(yīng)體系、最適退火溫度、最佳循環(huán)次數(shù)對(duì)體系延伸時(shí)間進(jìn)行梯度試驗(yàn)，設(shè)60、90、120 s 3個(gè)梯度，每個(gè)梯度2個(gè)重復(fù)。

1.2.6最佳體系的驗(yàn)證 利用優(yōu)化出的結(jié)果即最佳反應(yīng)體系，引物的最適退火溫度、最適循環(huán)數(shù)、最適延伸時(shí)間對(duì)試驗(yàn)材料進(jìn)行驗(yàn)證，以提高優(yōu)化體系的穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1DNA提取結(jié)果 通過紫外分光光度計(jì)檢測，所提取的DNA OD260/OD280的比值為1.70～1.90，說明DNA純度比較高，進(jìn)一步通過0.8%的瓊脂糖電泳檢測(圖1)，得到清晰、無降解的條帶，說明DNA完整性較好，可用于ISSR-PCR擴(kuò)增反應(yīng)。

圖1 CTAB法提取的垂穗披堿草基因組DNA

2.2正交試驗(yàn)的直觀分析 垂穗披堿草正交試驗(yàn)的PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果如圖2，正交試驗(yàn)的結(jié)果不盡相同，原因可能是其組合與最佳組合組分相差較大。1～16組合擴(kuò)增出的條帶分別為：0、0；4、1；6、1；1、2；8、8；8、9；9、10；10、10；2、0；9、9；10、10；7、9；4、0；8、8；8、7；6、4?？梢钥闯鎏幚?、6、7、8、10、11、14、15擴(kuò)增條帶較多，而6、7、11、15主帶更為清晰明顯，因此這4個(gè)處理在垂穗披堿草中擴(kuò)增效果最好。

從表5均值分析和表6的極差分析可知，各因素對(duì)垂穗披堿草ISSR-PCR反應(yīng)的影響程度從大到小依次為：TaqDNA聚合酶、Mg2+、引物、dNTPs、模板DNA。

圖2 正交試驗(yàn)PCR電泳產(chǎn)物(引物UBC822)

表5 因素水平均值分析

2.3方差分析 直觀分析法比較簡單易懂，只需對(duì)結(jié)果作少量計(jì)算，就可以得到最佳配合比和因素影響程度，但直觀分析法不能正確估計(jì)試驗(yàn)過程中誤差的大小，不能說明某因素水平所對(duì)應(yīng)的差異究竟是因素水平引起的還是試驗(yàn)誤差引起的，但是方差分析能彌補(bǔ)這個(gè)不足，本試驗(yàn)用SAS 8.0對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析。

各因素對(duì)垂穗披堿草ISSR-PCR反應(yīng)的影響程度從大到小依次為：TaqDNA聚合酶、Mg2+、引物、dNTPs、模板DNA，結(jié)果與極差分析相同(表7)。

方差分析的結(jié)果表明，模板DNA濃度、dNTPs對(duì)結(jié)果的影響未達(dá)到顯著水平；引物濃度對(duì)結(jié)果的影響達(dá)到了顯著水平，而TaqDNA聚合酶、Mg2+對(duì)結(jié)果的影響都達(dá)到了極顯著水平，所以有必要對(duì)TaqDNA聚合酶用量、Mg2+、引物濃度進(jìn)行水平間的多重比較。

2.4各因素對(duì)ISSR-PCR擴(kuò)增的影響

2.4.1TaqDNA聚合酶濃度對(duì)ISSR-PCR擴(kuò)增的影響 TaqDNA聚合酶濃度在PCR中的用量受到反應(yīng)體積、酶活性、酶耐熱性等因素的制約，TaqDNA聚合酶用量過多會(huì)引起非特異性反應(yīng)，在凝膠上出現(xiàn)較深的背景，影響檢測結(jié)果，而且還會(huì)增加成本；TaqDNA聚合酶濃度過低，合成產(chǎn)物的量會(huì)減少，也會(huì)影響試驗(yàn)結(jié)果。極差分析和方差分析發(fā)現(xiàn)，本試驗(yàn)條件下TaqDNA聚合酶用量對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響最大，與謝運(yùn)海等[16]的研究結(jié)果相似。當(dāng)TaqDNA聚合酶用量為1.0 U時(shí)，垂穗披堿草擴(kuò)增效果最好，高于或者低于此用量，擴(kuò)增條帶數(shù)變少(圖3)。從圖2可知，TaqDNA聚合酶為1.0 U時(shí)，條帶最清晰，主帶最明顯，帶數(shù)更多。經(jīng)多重比較分析(圖3)，TaqDNA聚合酶酶量為1.0 U時(shí)，與0.5、1.5、2.0 U 3個(gè)水平間差異均達(dá)到顯著水平。故本試驗(yàn)條件下，TaqDNA聚合酶的最適用量為1.0 U。

表6 因素水平極差分析

表7 正交試驗(yàn)方差分析

圖3 不同TaqDNA聚合酶量下DNA條帶數(shù)的均值

2.4.2Mg2+濃度對(duì)ISSR-PCR擴(kuò)增的影響 TaqDNA聚合酶是Mg2+依賴性酶，對(duì)Mg2+濃度較為敏感，Mg2+濃度除影響酶活性外，還影響引物退火、模板與PCR產(chǎn)物的解鏈溫度、引物二聚體的形成等[10]，所以Mg2+的濃度對(duì)PCR產(chǎn)物的特異性和產(chǎn)量影響明顯。過量的Mg2+會(huì)導(dǎo)致酶催化非特異性產(chǎn)物的擴(kuò)增，而Mg2+濃度過低，又使酶的催化活性降低[17]。Mg2+濃度為1.0 mmol/L時(shí)擴(kuò)增條帶數(shù)最少，高于此濃度時(shí)，條帶數(shù)明顯增多，濃度為2.0 mmol/L時(shí)條帶數(shù)最多(圖4)。由圖2可知，當(dāng)Mg2+濃度為1.0 mmol/L時(shí)(1、5、9、13號(hào)泳道)，只有1/4的泳道條帶數(shù)較明顯、清晰。多重比較表明(圖4)，Mg2+濃度為1.0 mmol/L時(shí)，DNA條帶數(shù)顯著低于其他3個(gè)水平，而其他3個(gè)水平間差異不顯著。所以確定的Mg2+最適濃度為2.0 mmol/L。

圖4 Mg2+與條帶均值關(guān)系

2.4.3引物濃度對(duì)ISSR-PCR擴(kuò)增的影響 ISSR擴(kuò)增條帶數(shù)與引物濃度密切相關(guān)，引物濃度過低時(shí)，PCR產(chǎn)物量降低，引物濃度過高又會(huì)促進(jìn)引物的錯(cuò)誤引導(dǎo)，導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增，還會(huì)增加引物二聚體的形成[18]，非特異性產(chǎn)物和引物二聚體又可作為PCR反應(yīng)的底物，與靶序列競爭DNA聚合酶和dNTPs底物，從而使靶序列的擴(kuò)增量減少[17]。當(dāng)引物濃度為0.20 μmol/L時(shí)，擴(kuò)增條帶數(shù)最少，低于或高于此濃度，擴(kuò)增條帶數(shù)逐漸增加(圖5)。多重分析表明，引物濃度為0.25 μmol/L時(shí)，與其他3個(gè)水平均有顯著差異，且相對(duì)于其他水平，條帶也更為清晰(圖2)，故確定引物濃度為0.25 μmol/L。

圖5 引物濃度與條帶均值關(guān)系

2.4.4dNTPs濃度對(duì)ISSR-PCR擴(kuò)增的影響 dNTPs濃度直接影響PCR擴(kuò)增，當(dāng)dNTPs濃度較低時(shí)，產(chǎn)生的條帶較少且弱，當(dāng)dNTPs濃度過低時(shí)，其與TaqDNA聚合酶競爭Mg2+，從而降低TaqDNA聚合酶活性，影響PCR結(jié)果。dNTPs在0.15、0.20和0.25 mmol/L水平上差異不顯著，三者顯著高于0.30 mmol/L(圖6)，dNTPs 濃度為0.25 mmol/L時(shí)擴(kuò)增條帶最清晰(圖2)，主帶最明顯，當(dāng)dNTPs 濃度為0.25 mmol/L時(shí)擴(kuò)增條帶最多。故該試驗(yàn)采用的最適dNTPs 濃度為0.25 mmol/L。

圖6 dNTPs濃度與條帶均值關(guān)系

2.4.5模板DNA濃度對(duì)ISSR-PCR擴(kuò)增的影響 模板DNA是ISSR擴(kuò)增的基礎(chǔ)，主要從純度和反應(yīng)量產(chǎn)生影響，模板量過低，引物不能有效配對(duì)，產(chǎn)物量小，模板量過高則過早消耗掉引物，使退火發(fā)生在模板DNA間或PCR間，反應(yīng)終止[19]。試驗(yàn)所選的4個(gè)水平的模板DNA濃度對(duì)PCR擴(kuò)增結(jié)果影響差異不顯著(圖7)，與白錦軍等[19]結(jié)果不同，但與桂騰琴等[20]的研究結(jié)果相似，這可能是與模板DNA的純度有關(guān)。本試驗(yàn)選取30～120 ng作為最佳模板質(zhì)量。

圖7 模板DNA與條帶均值關(guān)系

2.5退火溫度的確定 退火溫度決定著PCR的特異性。引物復(fù)性所需的溫度和時(shí)間取決于引物堿基組成、長度，降低退火溫度能保證模板與引物穩(wěn)定結(jié)合，但也可能導(dǎo)致產(chǎn)生錯(cuò)誤擴(kuò)增，一定范圍內(nèi)提高退火溫度可減少引物和模板之間的非特異性結(jié)合，提高PCR反應(yīng)的特異性。根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果所得的最佳反應(yīng)體系，即TaqDNA聚合酶1.0 U，Mg2+2.0 mmol/L，模板DNA 30～120 ng，dNTPs 0.25 mmol/L，引物0.25 μmol/L在DNAEngine(PTC-200)PCR儀上進(jìn)行退火溫度梯度試驗(yàn)。由圖8可知，退火溫度較低時(shí)(47.7、49.2℃)，擴(kuò)增條帶較弱，較彌散，條帶不清晰，擴(kuò)增條帶特異性差，54.4℃時(shí)條帶最清晰，條帶數(shù)最多，主帶最明顯，隨著退火溫度的升高擴(kuò)增的條帶數(shù)減少，到60.6℃幾乎沒有條帶，由此確定引物UBC822的最適退火溫度為54.4℃。通過對(duì)篩選出的11條擴(kuò)增穩(wěn)定、多態(tài)性較好的引物進(jìn)行了退火溫度梯度試驗(yàn)，并確定了各引物的最佳退火溫度(表8)。

表8 試驗(yàn)所選引物序列和退火溫度

圖8 溫度梯度PCR電泳圖

2.6最佳循環(huán)數(shù)和最適延伸時(shí)間的確定 根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果所得的最佳反應(yīng)體系，在最適退火溫度下，對(duì)PCR循環(huán)數(shù)進(jìn)行梯度試驗(yàn)，設(shè)置6個(gè)梯度。循環(huán)數(shù)較少時(shí)(35次)條帶不清晰，擴(kuò)增不穩(wěn)定，37次時(shí)擴(kuò)增條帶逐漸變清晰，但其主帶不明顯，循環(huán)數(shù)為41次時(shí)擴(kuò)增效果最好，循環(huán)數(shù)大于41次時(shí)，擴(kuò)增結(jié)果也不理想(圖9)。因此，41次作為引物UBC822的最佳循環(huán)次數(shù)。

圖9 最佳循環(huán)數(shù)的選擇

延伸時(shí)間的長短取決于待擴(kuò)增模板序列的長度和濃度，以及延伸溫度的高低，在條件一定的情況下，延伸時(shí)間過短無法完成擴(kuò)增導(dǎo)致擴(kuò)增產(chǎn)量低，延伸時(shí)間太長會(huì)引起非特異性條帶的產(chǎn)生[17]。利用最佳反應(yīng)體系、最適退火溫度和最佳循環(huán)數(shù)，對(duì)PCR延伸時(shí)間進(jìn)行梯度試驗(yàn)，設(shè)置3個(gè)梯度。延伸時(shí)間為60 s時(shí)擴(kuò)增條帶彌散，延伸時(shí)間為120 s時(shí)主帶不明顯也帶有一定的彌散現(xiàn)象，延伸時(shí)間為90 s時(shí)擴(kuò)增效果最好(圖10)，故確定最適延伸時(shí)間為90 s。

2.7最佳反應(yīng)體系的驗(yàn)證 運(yùn)用正交設(shè)計(jì)所獲得的最佳反應(yīng)體系和程序隨機(jī)選用引物UBC825對(duì)17份不同的野生垂穗披堿草進(jìn)行ISSR擴(kuò)增，結(jié)果顯示，擴(kuò)增條帶清晰，穩(wěn)定性好、多態(tài)性豐富(圖11)，表明該反應(yīng)體系和反應(yīng)程序穩(wěn)定性、重復(fù)性較好，適合于垂穗披堿草進(jìn)行ISSR-PCR反應(yīng)。

圖10 最適延伸時(shí)間的選擇

圖11 最佳反應(yīng)體系的驗(yàn)證

3 結(jié)論

本研究利用正交優(yōu)化設(shè)計(jì)建立了垂穗披堿草的ISSR-PCR反應(yīng)體系，試驗(yàn)過程中對(duì)影響PCR擴(kuò)增的TaqDNA聚合酶、Mg2+、模板DNA、dNTPs、引物等因素進(jìn)行了正交優(yōu)化，對(duì)PCR程序進(jìn)行了梯度試驗(yàn)，通過對(duì)擴(kuò)增結(jié)果的量化分析得到了穩(wěn)定性好的反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序，即：TaqDNA聚合酶1.0 U，Mg2+2.0 mmol/L，模板DNA 30～120 ng，dNTPs 0.25 mmol/L，引物0.25 μmol/L；PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性2 min，94℃變性1 min，51℃退火1 min(視不同引物而定)，72℃延伸1.5 min，共41個(gè)循環(huán)，72℃后延伸10 min，擴(kuò)增完后4℃保存。

正交設(shè)計(jì)相對(duì)于其他設(shè)計(jì)方法節(jié)省了人力和財(cái)力，對(duì)結(jié)果的分析更均衡更完善，但對(duì)擴(kuò)增效果的評(píng)價(jià)方面帶有一定的主觀性，不能很好地評(píng)估各因素之間的交互作用，還需更客觀的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。此外，在正交優(yōu)化中所設(shè)置的濃度梯度較大，可采用與單因素試驗(yàn)或細(xì)調(diào)性正交試驗(yàn)[21]相結(jié)合的方法進(jìn)一步確定最優(yōu)體系。盡管如此，本研究所建立的較為穩(wěn)定的ISSR-PCR反應(yīng)體系，可以為垂穗披堿草的研究提供科學(xué)的理論基礎(chǔ)，同時(shí)為披堿草屬內(nèi)其他種在品種鑒定、遺傳多樣性研究、親緣關(guān)系分析等領(lǐng)域提供一定的依據(jù)。

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