王鳴剛，駱換濤，李志忠，吳亦亮

(1.蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730050； 2.廈門大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建 廈門 361005)

隨著工業(yè)的迅速發(fā)展，環(huán)境中重金屬的污染已成為影響環(huán)境和人類健康的一個重要問題[1]。在重金屬離子的誘導(dǎo)下，植物細(xì)胞內(nèi)的植物螯合肽合成酶(phytochelatin synthase，PCS)能夠以谷氨酰半胱氨酸(glutamylcysteine，GSH)為底物迅速合成植物螯合肽(phytochelatin，PC)[2]，PC可與金屬離子螯合，形成復(fù)合物，通過液泡上的ABC型轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白運(yùn)輸?shù)揭号輳亩鴮⒅亟饘匐x子隔離[3]。近幾年，PCS基因已分別從多種不同的植物中克隆[4]，研究表明，過量表達(dá)GSH合成途徑中的關(guān)鍵酶，可明顯提高植物對重金屬的耐受和積累[5-6]。含有過量表達(dá)植物螯合肽合成酶基因的轉(zhuǎn)基因植株可作為理想的植物，用于對重金屬污染的土壤進(jìn)行生物修復(fù)。

苜蓿(Medicagosativa)適應(yīng)性廣、生長迅速及生物量大，是用于污染土壤生物修復(fù)的較好材料[7-8]。本研究以克隆的擬南芥(Arabidopsisthaliana)基因AtPCS1，構(gòu)建植物表達(dá)載體pBⅠ121-AtPCS1，通過農(nóng)桿菌EHA105介導(dǎo)轉(zhuǎn)化苜蓿，期望獲得轉(zhuǎn)AtPCS1基因植株，為今后培育能夠“超富集”重金屬的苜蓿提供基礎(chǔ)材料。

1 材料與方法

1.1材料 甘農(nóng)一號苜蓿種子由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院提供。

1)菌種、表達(dá)載體：農(nóng)桿菌EHA105，質(zhì)粒pET28a-AtPCS1，載體pBPF及pBⅠ121均為蘭州理工大學(xué)植物細(xì)胞與分子生物學(xué)實驗室保存。

2)PCR擴(kuò)增引物：AtPCS1、NPTⅡ引物由Invitrogen(上海)公司合成，序列如下：

AtPCS1-sense-3(正向引物)：5’-AAGGATCCAATGGCTAGCGCGAGTTTAT-3’；

AtPCS1-antisense-3(反向引物)： 5’-AAGAATTCACTAATAGGCAGGAGCAGCG-3’；

NPTⅡ-sencse(正向引物)：5’-GGCTATGACTGGGCACAACA-3’；

NPTⅡ-antisense(反向引物)：5’- GATACCGTAAAGCACGAGGA-3’。

3)培養(yǎng)基：B5HKT為B5H培養(yǎng)基+50 mg/L Kan+300 mg/L Timentin；

B5KT為B5培養(yǎng)基+50 mg/L Kan+300 mg/L Timentin； 1/2 MSKT為1/2 MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基(蔗糖質(zhì)量濃度10 g/L)+50 mg/L Kan+100 mg/L Timentin。

1.2植物表達(dá)載體的構(gòu)建 以AtPCS1-sense-3/AtPCS1-antisense-3作為引物，以質(zhì)粒pET28a-AtPCS1為模板，PCR擴(kuò)增擬南芥植物螯合肽合成酶基因。PCR產(chǎn)物濃縮后經(jīng)BamHⅠ、EcoRⅠ雙酶切，連入中間載體pBPF，在基因上游加入35S啟動子，下游加入nos終止子，得中間質(zhì)粒pBPF-AtPCS1；Hind Ⅲ單酶切質(zhì)粒pBPF-AtPCS1獲得含啟動子、目的基因及終止子的DNA片斷；將得到的目的片斷連入經(jīng)Hind Ⅲ單酶切的pBⅠ121，得到植物表達(dá)載體pBⅠ121-AtPCS1。

1.3苜?？敲顾?Kan)抗性壓的篩選 在B5H培養(yǎng)基中添加卡那霉素，設(shè)25、50及75 mg/L 3個質(zhì)量濃度梯度。每組濃度設(shè)4個重復(fù)，每個重復(fù)放置7塊葉片。20 d后統(tǒng)計外植體的出愈率并觀察愈傷生長狀況。

1.4含AtPCS1基因的農(nóng)桿菌侵染苜蓿葉片 取新鮮苜蓿葉片，滅菌后切成1 cm2的小塊，預(yù)培養(yǎng)4 d，備用；待農(nóng)桿菌培養(yǎng)至OD600約為0.6時，取1 mL菌液加到9 mL MS液體培養(yǎng)基中混勻；將預(yù)培養(yǎng)的葉片加入到上述混合液中，與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)20 min。取出侵染后的葉片，置于B5H培養(yǎng)基中，暗培養(yǎng)4 d。

1.5再生植株的獲得與移植 共培養(yǎng)4 d后的苜蓿葉片移植到B5HKT培養(yǎng)基中誘導(dǎo)愈傷，并在B5KT中誘導(dǎo)分化。分化出小苗后將再生苗移植到1/2MSKT中誘導(dǎo)生根；待苗長出2～3條粗壯的根后，溫室中煉苗4～5 d移植到營養(yǎng)缽中培養(yǎng)；溫室培養(yǎng)1個月，幼苗移植到大盆中，室外培養(yǎng)。

1.6轉(zhuǎn)基因再生苗的PCR鑒定 以采用改進(jìn)的CTAB法[9]提取轉(zhuǎn)基因再生植株的基因組DNA,以其為模板，通過PCR方法鑒定再生植株。引物分別采用AtPCS1-sense-3/AtPCS1-antisense-3和NPTⅡ-sense/NPTⅡ-antisense。

2 結(jié)果與分析

2.1AtPCS1基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建和農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子的鑒定 根據(jù)AtPCS1基因序列設(shè)計引物，在sense 引物中加入BamHⅠ酶切位點，antisense引物加入EcoRⅠ酶切位點，通過PCR得到目的片斷(大小約1.4 kb)。目的片斷通過BamHⅠ/EcoRⅠ雙酶切后，連入中間載體pBPF，在AtPCS1基因的上下游分別加入35S啟動子及nos終止子(約3.2 kb)。對中間載體pBPF-AtPCS1作HindⅢ單酶切后，回收上述表達(dá)元件，插入到pBⅠ121中得到植物表達(dá)載體pBⅠ121-AtPCS1(圖1)。通過酶切鑒定，證明已獲得陽性克隆(圖2)。將構(gòu)建好的質(zhì)粒測序，結(jié)果表明所得基因序列準(zhǔn)確無誤。提取質(zhì)粒pBⅠ121-AtPCS1轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，通過菌落PCR鑒定獲得陽性轉(zhuǎn)化子(圖3)，即獲得含AtPCS1基因的農(nóng)桿菌。

2.2Kan選擇壓的確定 結(jié)果表明，經(jīng)過20 d的培養(yǎng)，培養(yǎng)基含Kan質(zhì)量濃度為0 mg/L試驗組的外植體能長出塊大、含水量高的淡黃色愈傷組織。隨著培養(yǎng)基中Kan質(zhì)量濃度的提高，外植體逐漸變黃，長出的愈傷組織明顯弱小。在Kan質(zhì)量濃度為50 mg/L的培養(yǎng)基中，外植體葉片部分褐化死亡，部分正常長出愈傷；當(dāng)Kan質(zhì)量濃度加到75mg/L時，葉片10 d左右基本枯黃，多數(shù)不能正常愈傷化(表1)。選擇壓為50 mg/L時，長出的愈傷組織在含相同濃度Kan分化培養(yǎng)基上能夠分化出芽。因此確定以甘農(nóng)一號葉片作為轉(zhuǎn)化材料，其愈傷組織誘導(dǎo)分化Kan的選擇壓力為50 mg/L。

圖1 植物表達(dá)載體pBⅠ121-AtPCS1的構(gòu)建

圖2 重組質(zhì)粒pBⅠ121-AtPCS1的酶切鑒定

圖3 含AtPCS1基因的農(nóng)桿菌的PCR檢測

表1 不同選擇壓力對苜蓿葉片愈傷形成的影響

2.3AtPCS1基因?qū)胲俎＜爸仓暝偕?與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)4 d后，接種于B5HKT上篩選。10 d后葉片部分枯黃，但一些區(qū)域開始形成抗性愈傷組織，20 d后愈傷組織基本覆蓋葉片，含水量增高(圖4A)。在B5HKT上繼代1次后轉(zhuǎn)至B5KT上，約2周后抗性愈傷長出綠色的芽點，并很快的分化成芽(圖4B)，愈傷組織的分化率與無抗生素的條件下基本相同，且多為叢生芽，多的可達(dá)10～15個。將芽分離置于新的B5KT上培養(yǎng)，經(jīng)過25～30 d，胚性愈傷組織逐漸長出葉片，并在基部分化出根(圖4C)。

長出根后，將小苗移植到1/2MSKT上繼續(xù)誘導(dǎo)根的生長。轉(zhuǎn)基因再生苗的生根能力差別較明顯，只有少數(shù)苗在20 d后可長出多且粗壯的根，多數(shù)根的發(fā)育受到一定抑制，只長1條主根，基本無側(cè)根分化，影響再生苗移植到小盆中的成活率。后續(xù)試驗放棄了在生根培養(yǎng)基中添加Kan作為篩選壓，再生苗的生根情況明顯好轉(zhuǎn)。根系較為發(fā)達(dá)的再生苗，經(jīng)4～5 d煉苗后移植到營養(yǎng)缽中(圖4D)，溫室培養(yǎng)30 d后，將成活的苗移植到大盆中栽培(圖4E)。本試驗共獲得轉(zhuǎn)AtPCS1基因苜蓿再生植株57棵。

2.4轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR鑒定 隨機(jī)選取長勢旺盛的9株轉(zhuǎn)基因試驗組和1株未轉(zhuǎn)化的對照組再生苗的葉片，提取其基因組DNA，用NPTⅡ-sense/NPTⅡ-antisense及AtPCS1-sense-3/AtPCS1-antisense-3作為引物，進(jìn)行PCR鑒定。以NPTⅡ特異引物對9株試驗組和1株對照組植株進(jìn)行檢測，試驗組陽性6株(圖5)，陽性苗比率達(dá)到66.7%。上述陽性樣品進(jìn)一步用AtPCS1引物鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn),除6號外，其余各樣品均能擴(kuò)增出目的基因大小一致的片斷(圖6)，對照組沒有得到相應(yīng)的擴(kuò)增帶。初步結(jié)果表明，AtPCS1基因已轉(zhuǎn)入苜蓿中。

3 討論

3.1農(nóng)桿菌菌株對轉(zhuǎn)化效率的影響 在苜蓿的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)方面，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法已有較多的報道[10]。韓利芳和張玉發(fā)[11]利用胭脂堿型菌株C58將煙草MnSOD基因轉(zhuǎn)入保定苜蓿，陽性率達(dá)到84%，但轉(zhuǎn)化效率似乎偏低；黎外奎等[12]用琥珀堿型菌株EHA105將肝片吸蟲抗原基因轉(zhuǎn)入紫花苜蓿，成功獲得了含肝片吸蟲保護(hù)性抗原基因FH3的轉(zhuǎn)基因苜蓿；Mesfin等[13]則選用章魚堿型菌株LBA4404 成功的將蘋果酸脫氫酶基因轉(zhuǎn)入苜蓿，獲得了9棵轉(zhuǎn)基因植株，轉(zhuǎn)基因植株根部有機(jī)酸含量提高了4.2～7.1倍，顯著提高了植株對鋁的耐受能力。而Asma 等[14]在曼氏溶血桿菌A1的重要保護(hù)性抗原Lkt(leukotoxin)基因轉(zhuǎn)化苜蓿的研究中比較了菌株LBA4404 及C58 的轉(zhuǎn)化能力，結(jié)果表明,相對于菌株LBA4404，C58 侵染的外植體愈傷組織啟動時間及形成的數(shù)量都明顯減少，但是再生植株的陽性率明顯提高。

圖4 轉(zhuǎn)AtPCS1基因的甘農(nóng)一號苜蓿分化、再生情況

圖5 NPT Ⅱ 特異引物對轉(zhuǎn)基因苜蓿的PCR 檢測

圖6 AtPCS1 特異引物對轉(zhuǎn)基因苜蓿的PCR 檢測

本試驗主要使用農(nóng)桿菌EHA105 作為侵染菌株，經(jīng)EHA105 菌侵染后，外植體基本上都可以正常形成愈傷組織，其后的分化率并未受到影響。由于使用的再生體系中形成的愈傷組織含水量高、漿狀，GUS 染色結(jié)果較難觀察，但從PCR 鑒定的結(jié)果可以看出，陽性率為66.7%。另外，也使用了LBA4404 作為侵染菌，結(jié)果表明，侵染后的外植體愈傷形成及分化率變化都不大(數(shù)據(jù)未發(fā)表)，但是每塊愈傷組織上分化的芽數(shù)量只有2～5個，相對EHA105 侵染后的葉片可以分化多達(dá)10個的芽明顯減少，同時考慮到菌株LBA4404 培養(yǎng)過程容易結(jié)塊，影響后續(xù)的轉(zhuǎn)化。因此，在后續(xù)的試驗中使用EHA105 作為主要的侵染菌株。

3.2預(yù)培養(yǎng)對轉(zhuǎn)化效率的影響 多數(shù)研究者認(rèn)為，預(yù)培養(yǎng)可促進(jìn)細(xì)胞分裂，分裂狀態(tài)的細(xì)胞更易整合外源DNA，從而提高外源基因的短暫表達(dá)和穩(wěn)定整合率。陳晨等[15]對預(yù)培養(yǎng)影響苜蓿的轉(zhuǎn)化效率做了詳細(xì)的研究，認(rèn)為預(yù)培養(yǎng)5 d抗性愈傷的形成率及穩(wěn)定轉(zhuǎn)化率都最高，且GUS染色后藍(lán)色斑點布滿葉片的中間，表明農(nóng)桿菌侵染的比較深入。因此，在農(nóng)桿菌侵染外植體之前，一般將外植體先在培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)一定的時間。本試驗在農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化前對葉片進(jìn)行4 d的預(yù)培養(yǎng)。

此外，農(nóng)桿菌侵染外植體時間及共培養(yǎng)時間也會影響轉(zhuǎn)化效率。侵染時間要適宜，一方面農(nóng)桿菌需充分接觸外植體，另一方面要減少細(xì)菌對植物細(xì)胞的毒害作用。陳晨等[15]研究表明苜蓿葉片侵染時間為20 min時，瞬時表達(dá)率及抗性愈傷形成率最高。參考不同研究者的方法，本試驗采用20 min作為侵染時間。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，一般共培養(yǎng)到第4天時農(nóng)桿菌就大量生長，覆蓋整個葉片。繼續(xù)培養(yǎng)葉片會萎蔫，且不利于后面葉片的抑菌培養(yǎng)、分化。因此，采用共培養(yǎng)3 d后置于含Timentin 的培養(yǎng)基中，抑菌培養(yǎng)并誘導(dǎo)愈傷的形成。

3.3篩選壓對轉(zhuǎn)化效率的影響 合適的篩選壓能夠充分殺死非轉(zhuǎn)化細(xì)胞或抑制其生長分化，提高篩選效率。多數(shù)研究者采用一步法，但為了提高篩選效率和防止篩選壓力過度對所有植物細(xì)胞造成損傷，也有一些研究者采用多步篩選法。在外植體最初誘導(dǎo)形成愈傷組織的幾周采用較低的篩選壓，待愈傷組織長到一定程度后，提高抗生素的濃度[16]，也有人采用篩選壓濃度先高后低的方法[17]。多步法篩選得到的再生苗陽性率較高，但前者容易產(chǎn)生嵌合體，后者則由于開始篩選壓過高導(dǎo)致多數(shù)細(xì)胞無法正常生長、分化而導(dǎo)致再生率較低。在轉(zhuǎn)基因苜蓿研究中，通常采用Austin建立的一步法。本試驗在甘農(nóng)一號葉片愈傷形成、分化及生根過程中均使用50 mg/L的Kan作為篩選壓，結(jié)果表明，陽性率達(dá)到50%，篩選效率較高。但Kan質(zhì)量濃度在50 mg/L時，再生苗生根明顯受到抑制，根生長緩慢且很少有根毛的分化，這可能是根組織相對于葉片對Kan更為敏感。黎外奎等[12]、黎茵等[18]在各自的研究中均使用無抗生素的培養(yǎng)基誘導(dǎo)生根，本試驗后期也采用了無抗生素培養(yǎng)基誘導(dǎo)生根。但取少數(shù)根長勢較好的無菌苗葉片進(jìn)行PCR鑒定時，發(fā)現(xiàn)陽性率明顯降低，只有66.7%。因此，需進(jìn)一步篩選合適生根的Kan濃度，完善苜蓿遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。

3.4植株的再生及檢測 苗移植1周左右，多數(shù)植株開始萌發(fā)新葉穩(wěn)定生長，葉片大、節(jié)間長。試驗發(fā)現(xiàn)并不是所有植株都能旺盛生長，At10、At12兩棵苗移植一個半月后仍無明顯的壯大，葉片小且節(jié)間短。這可能由于外源片斷隨機(jī)插入苜蓿染色體中導(dǎo)致某些莖葉發(fā)育相關(guān)的基因失活或者外源基因的過量表達(dá)影響了苜蓿正常的生長，這些需要進(jìn)一步分子生物學(xué)試驗加以驗證。9棵再生苗用NPTⅡ特異引物PCR檢測獲得6棵陽性植株，對此6棵陽性苗用AtPCS1 特異引物進(jìn)行進(jìn)一步PCR鑒定，發(fā)現(xiàn)樣品At4為陰性，表明AtPCS1基因已丟失。這種外源片斷的丟失可能發(fā)生在質(zhì)粒的復(fù)制過程中，也可能是插入苜蓿染色體后由于基因的重組引起的。其他關(guān)于轉(zhuǎn)基因植株轉(zhuǎn)錄及表達(dá)AtPCS1能力和轉(zhuǎn)基因植株富集重金屬能力的試驗正在進(jìn)行中，相關(guān)結(jié)果將陸續(xù)發(fā)表。

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