周瑩潔，王顯國，張新全

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)科學(xué)系，四川 雅安 625014；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)草地研究所，北京 100193)

野牛草(Buchloedactyloides)別名水牛草、牛毛草，禾本科畫眉草亞科野牛草屬多年生暖季型C4草本植物，原產(chǎn)于北美中部半干旱溫帶和亞熱帶地區(qū)，是北美干草原的特有草種[1]。由于它具有抗逆性強(qiáng)，易養(yǎng)護(hù)管理等優(yōu)良的坪用特性，因此從最初主要被用作牧草，逐漸被用作園林綠化植物。20世紀(jì)40年代作為水土保持植物引種到我國，已在西北、華北及東北地區(qū)廣泛種植。近年來，隨著冷季型草坪草耗水量大、養(yǎng)護(hù)強(qiáng)度高等問題的突顯，野牛草成為北方和缺水地區(qū)綠化及水土保持的首選草種。

至今，關(guān)于野牛草遺傳多樣性的研究多見于國外的報(bào)道。Huff等[2]用RAPD標(biāo)記發(fā)現(xiàn)野牛草自然異性雜交群體內(nèi)多樣性大于群體間多樣性。Zhang等[3]對(duì)野牛草遺傳多樣性RAPD分析得出10份野牛草種質(zhì)相似系數(shù)分布范圍為0.30～0.89。Budak等[4-5]利用SRAP標(biāo)記分析53份野牛草基因型之間的遺傳多樣性及表型關(guān)系，以及不同倍性水平野牛草的遺傳多樣性，結(jié)果表明控制性狀的基因型極易區(qū)分草坪草的品質(zhì)和顏色，各倍性基因型之間的遺傳距離為0.33～0.99，說明 SRAP標(biāo)記是遺傳多樣性評(píng)價(jià)、鑒別特異基因型及從分子水平上分析野牛草栽培種的進(jìn)化與培育的有效工具；同時(shí)還利用ISSR、SSR、RAPD和SRAP四種分子標(biāo)記分析了種子繁殖類型和營養(yǎng)體繁殖類型野牛草之間的遺傳關(guān)系，這些標(biāo)記都可區(qū)分研究材料，其中SRAP標(biāo)記多態(tài)性豐富，適合應(yīng)用于野牛草近緣栽培種遺傳多樣性研究。劉莉等[6]利用ISSR分子標(biāo)記和表型性狀研究野牛草實(shí)生苗群體內(nèi)的多樣性，研究發(fā)現(xiàn)野牛草群體內(nèi)的遺傳多樣性較高，相似系數(shù)為0.58～0.82，ISSR標(biāo)記聚類結(jié)果與形態(tài)特征沒有明確的對(duì)應(yīng)關(guān)系。

相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性 (sequence-related amplified polymorphism,SRAP)標(biāo)記自從2001年開發(fā)以來，已被廣泛應(yīng)用于多種植物的圖譜構(gòu)建、基因定位、比較基因組學(xué)和遺傳多樣性分析等研究領(lǐng)域[7]。在草業(yè)科學(xué)領(lǐng)域中，已有關(guān)于鴨茅(Dactylisglomerata)[8]、狗牙根(Cynodondactylon)[9]和結(jié)縷草屬[10]等植物SRAP標(biāo)記遺傳多樣性的報(bào)道。

目前國內(nèi)還未見有關(guān)野牛草SRAP遺傳多樣性研究的報(bào)道，本研究采用SRAP分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)來自31份國外野牛草種質(zhì)資源進(jìn)行分析，為野牛草新品種的培育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1供試材料 供試材料為中國農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)科學(xué)系收集的31份材料，包括28份野生材料和3個(gè)栽培品種。其中29份來自美國，1份來自加拿大，另1份來自日本(表1)。

表1 供試材料

1.2基因組DNA提取與檢測 采用CTAB方法提取DNA[11]，提取的DNA儲(chǔ)存于4 ℃冰箱中備用。在0.8%的瓊脂糖凝膠上，1×TBE緩沖液條件下電泳，以已知含量的λDNA為對(duì)照，檢測DNA的濃度[12-13]。

1.3PCR擴(kuò)增體系 SRAP標(biāo)記引物序列來自Li和Qurios[14]及Guo和Luo[15]的報(bào)道，12個(gè)上游引物和19個(gè)下游引物組合成228對(duì)引物序列，由上海生工生物公司合成。選取4個(gè)DNA質(zhì)量較高且田間試驗(yàn)性狀表現(xiàn)差異較大的材料對(duì)引物進(jìn)行篩選，選出19對(duì)條帶清晰，多態(tài)性好的引物組合用于野牛草SRAP遺傳多樣性研究，引物序列見表2。

反應(yīng)總體積為15 μL，反應(yīng)最終濃度：30 ng DNA，0.4 μmol/L引物，0.75 U Taq DNA 聚合酶，250 μmol/L dNTPs，1.5 mmol/L MgCl2。PCR擴(kuò)增反應(yīng)在Biometra PCR儀上進(jìn)行，擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性1 min，35 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，5個(gè)循環(huán)；94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。

擴(kuò)增產(chǎn)物用非變性聚丙烯酰胺凝膠(丙烯酰胺∶甲叉=39∶1，1×TBE)電泳分離。在200 V電壓下電泳120～150 min，電泳結(jié)束后快速銀染檢測，凝膠用數(shù)碼相機(jī)拍照并保存[16]。

1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析 對(duì)清晰可重復(fù)的DNA條帶進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，在相同遷移位置，有帶記為1，無帶記為0，不同引物擴(kuò)增的結(jié)果構(gòu)成原始的“0,1”二元數(shù)據(jù)矩陣。按Nei-Li[17]方法計(jì)算供試材料間遺傳相似系數(shù)(GS,即Dice系數(shù))，GS=2Nij/(Ni+Nj),式中，Ni為材料i中出現(xiàn)的譜帶數(shù)，Nj為材料j中出現(xiàn)的譜帶數(shù)，Nij為材料i和材料j共有的譜帶數(shù)。利用NTSYS-pc軟件按Nei-Li遺傳相似系數(shù)的非加權(quán)成對(duì)算術(shù)平均法(UPGMA)進(jìn)行各種質(zhì)材料間的聚類分析[18]。進(jìn)行基于遺傳相似系數(shù)的主成分分析(principal components analysis,PCA),依據(jù)引起變異的最大第1主向量、第2主向量作出各份種質(zhì)材料的2-D散點(diǎn)分布圖。

表2 用于野牛草SRAP分析的引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1供試材料SRAP擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性 利用19對(duì)引物組合對(duì)31份野牛草基因組DNA進(jìn)行SRAP擴(kuò)增，共擴(kuò)增出312條清晰的條帶。其中多態(tài)性條帶271條，多態(tài)性條帶比率(percentage of polymorphic band,PPB)為85.79%，擴(kuò)增DNA片段大小集中在50～1 500 bp。引物組合Me6-Em16擴(kuò)增出最多的26條帶，Me1-Em16擴(kuò)增的條帶最少，僅有7條。平均每對(duì)引物擴(kuò)增出16.42條帶，其中14.26條具有多態(tài)性，每對(duì)引物擴(kuò)增的多態(tài)性位點(diǎn)百分率為69.23%～100%(表3)。

表3 SRAP標(biāo)記引物擴(kuò)增結(jié)果

2.2野牛草SRAP標(biāo)記特異性缺失標(biāo)記及特異性標(biāo)記 在31份野牛草基因型中，15號(hào)野生材料在Me3-Em13引物組合擴(kuò)增時(shí)缺失一條50 bp左右擴(kuò)增帶，可以作為15號(hào)材料種質(zhì)鑒定的特異標(biāo)記。在Me10-Em15擴(kuò)增產(chǎn)物中，品種Texoka在50 bp附近出現(xiàn)特異性條帶，其他材料都沒有此條帶，同時(shí)Me3-Em5對(duì)15號(hào)材料能擴(kuò)增出400 bp處的特異帶。這些特異性缺失標(biāo)記和特異性標(biāo)記都可以作為野牛草品種鑒定的重要依據(jù)。

2.3供試材料的遺傳相似性 對(duì)擴(kuò)增結(jié)果采用Nei-Li相似系數(shù)的計(jì)算方法，得到相似性矩陣。31份野牛草供試材料的GS變異范圍為0.586 5～0.916 7，平均GS值為0.669 1。從遺傳相似矩陣可以看出，27號(hào)和31號(hào)材料的遺傳相似性最高，親緣關(guān)系最近，18號(hào)和29號(hào)材料之間的遺傳相似性最小，遺傳距離最大表明親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。這些結(jié)果說明供試野牛草之間差異明顯，具有較為豐富的遺傳多樣性。

2.4供試材料的聚類分析和主向量分析 基于Nei-Li相似系數(shù)，采用NTSYS-pc繪制出UPGMA聚類圖(圖1)。從聚類圖可以看出，把31份材料聚為兩大類，第一類共包括了25份材料，其中包括20份美國野生材料，3份栽培品種和1份加拿大和1份日本的野生材料，第二類包括了6份美國野生材料。同時(shí)，基于Nei-Li相似系數(shù)，利用NTSYS-pc對(duì)這些材料進(jìn)行主向量分析，繪制出前兩個(gè)主向量2-D散點(diǎn)分布圖(圖2)。從圖2 可知，第一主向量和第二主向量分別能夠接受總的遺傳變異的21.98%和1.06%。主向量分析的結(jié)果和聚類分析結(jié)果基本一致，兩類材料可明顯的區(qū)分開來。

3 討論

通過SRAP標(biāo)記對(duì)31份野牛草材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分析其遺傳狀況。本研究得到的多態(tài)性比率為85.79%。雖然低于此前Budak等[4-5]利用SRAP技術(shù)對(duì)野牛草遺傳多樣性研究的結(jié)果，但是高于ISSR和RAPD兩個(gè)標(biāo)記的結(jié)果。本研究利用16個(gè)引物組合共擴(kuò)增出271條多態(tài)性帶，平均每個(gè)引物組合擴(kuò)增多態(tài)性帶14.26條，說明SRAP對(duì)野牛草的擴(kuò)增效率較高，可用于標(biāo)記評(píng)價(jià)野牛草基因型的遺傳分析，也適用于對(duì)大量種質(zhì)的遺傳變異檢測。

由于SRAP標(biāo)記的引物特點(diǎn)，此標(biāo)記在重要基因性狀標(biāo)記的輔助選擇上起到了重大的作用。Li等[19]在大白菜(Brassicacampestris)中發(fā)現(xiàn)與雄性不育基因有關(guān)的SRAP標(biāo)記，并且篩選到與芹菜(Apiumgraveolens)病毒抗性基因緊密連鎖的SRAP標(biāo)記。本研究在對(duì)31份野牛草材料進(jìn)行SRAP標(biāo)記分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，某些材料用特定的引物組合擴(kuò)增以后，會(huì)出現(xiàn)一些特異性缺失的條帶及特異性的條帶，這些特異性缺失條帶和特異性的條帶可為野牛草的品種鑒定及親本選擇提供必要的理論依據(jù)。此外，野牛草是比較少見的雌雄異株禾本科草坪草，如能利用SRAP標(biāo)記篩選到與其性別相關(guān)的基因，可為野牛草性別早期鑒定和揭示性別分化程序表達(dá)的機(jī)理提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持。

圖1 31份野牛草材料基于Nei-Li相似系數(shù)的UPGMA聚類

圖2 基于SRAP 數(shù)據(jù)的野牛草材料主向量分析

31份材料中，27號(hào)和31號(hào)材料的遺傳關(guān)系最近，18號(hào)和29號(hào)材料之間的遺傳相似性最小，親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。從供試材料的聚類圖和主向量分析可看出，地理來源相同的野牛草材料沒有聚為一類，與預(yù)期相比，來自美國的29份材料并沒有單獨(dú)的聚在一類，不符合地理生態(tài)環(huán)境的分布。有較多關(guān)于牧草或草坪草遺傳多樣性的文獻(xiàn)都報(bào)道相似生境或地理來源的類群會(huì)優(yōu)先聚為一類[8,20-21]。本研究這種聚類不符合地域性分布規(guī)律的原因可能有以下幾種：一是樣本的數(shù)量有限，來自日本和加拿大的種質(zhì)數(shù)量太少，各自只有一份，導(dǎo)致其特異帶在總條帶中的比例很小，可能對(duì)各群體遺傳多樣性指數(shù)的比較產(chǎn)生了影響，有研究[22]指出，在盡量多的起源地取代表性的種源進(jìn)行研究才能得到更加準(zhǔn)確的結(jié)果；二是與野牛草混合生殖方式和基因突變有關(guān)；三是這些材料都是在20世紀(jì)80和90年代引入中國，相同的生境條件產(chǎn)生了具有相同的選擇壓力，形成了相似的生態(tài)類型。

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