李叔偉， 林巍 ，劉新雷，姜麗萍，姜宇，葛銘

（1．哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司，黑龍江哈爾濱 150069；2．東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030）

長(zhǎng)期以來，生產(chǎn)中多用抗生素等化學(xué)類制劑做飼料添加劑。已知抗生素可在動(dòng)物體內(nèi)殘留，致使動(dòng)物產(chǎn)生耐藥性，引起致癌、致畸和致突變，并能通過食物鏈危害人類健康。中草藥為天然動(dòng)植物產(chǎn)品，一些常用中草藥兼有營(yíng)養(yǎng)與藥用兩種屬性，富含蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素和微量元素等養(yǎng)分，研究表明，具有補(bǔ)益作用的中草藥均具有增強(qiáng)免疫的功能,枸杞子具有提高動(dòng)物細(xì)胞免疫與體液免疫的功能，中草藥添加劑可顯著提高雞淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率，黃芪可提高大鼠抗體產(chǎn)量，具有提高體液免疫的功能。本實(shí)驗(yàn)選用黃芪、黨參、當(dāng)歸、白術(shù)4味中草藥，旨在探討中草藥添加劑的促生長(zhǎng)作用和增強(qiáng)免疫的功能，同時(shí)也為進(jìn)一步研究中草藥添加劑的營(yíng)養(yǎng)與免疫功能提供依據(jù)。

一、材料與方法

1.中草藥。黃芪、黨參、當(dāng)歸、白術(shù)，購(gòu)自哈爾濱中醫(yī)藥有限公司。按照祖國(guó)醫(yī)藥學(xué)傳統(tǒng)理論，合理組方，使藥物間產(chǎn)生協(xié)同作用。方劑：黃芪、黨參、當(dāng)歸、白術(shù)。

2.試驗(yàn)動(dòng)物與分組。將1日齡海蘭白雛雞100只，隨機(jī)分為C和L共2組，每組50只， C組為對(duì)照組，L組為實(shí)驗(yàn)組。自由采食、飲水量見表1，L組雛雞在飲水中添加方劑復(fù)方水煎劑，用量是雛雞日飲水量的2%，C組水中不添加任何藥物，在育雛期輔以保溫措施，實(shí)驗(yàn)期為5周，2組雞在相同條件下進(jìn)行飼養(yǎng)管理，每天兩次進(jìn)行觀察。分別于實(shí)驗(yàn)開始后的第7、14、21、28、35天隨機(jī)從每組各抽取相同數(shù)量雛雞，稱重、采血、處死取臟器，進(jìn)行免疫器官指數(shù)測(cè)定、巨噬細(xì)胞吞噬率檢測(cè)和外周血液細(xì)胞數(shù)量的檢測(cè)。

3.實(shí)驗(yàn)方法。

⑴體重及免疫器官指數(shù)的測(cè)定:于 7 d、14 d、21 d、28 d、35 d每組各組取7只雞，編號(hào)并稱重，然后處死，迅速取其免疫器官胸腺、脾臟、法氏囊，稱其濕重。計(jì)算免疫器官的指數(shù)，即免疫器官指數(shù)=免疫器官重量/雞體重×100%。

⑵白細(xì)胞數(shù)量測(cè)定：按常規(guī)方法計(jì)數(shù)分別于實(shí)驗(yàn)開始后的第7、14、21、28、35天隨機(jī)從每組抽取相同數(shù)量雛雞外周血液白細(xì)胞，用低倍鏡計(jì)數(shù)四角的四個(gè)大格內(nèi)的白細(xì)胞數(shù)（細(xì)胞數(shù)×10-3/mm3）。

計(jì)算：白細(xì)胞數(shù)/l=四個(gè)大格白細(xì)胞數(shù)÷4×10×20×106。

⑶淋巴細(xì)胞數(shù)量測(cè)定：分別于實(shí)驗(yàn)開始后的第7、14、21、28、35天隨機(jī)每組抽取相同數(shù)量雛雞翼靜脈針刺取血并推制血膜片，迅速吹干，用無水甲醇固定1 min，再用pH6.8的0.067 mol/LPBS10倍稀釋的姬姆薩染色液染色30 min，水洗干燥后常規(guī)分類計(jì)數(shù)。根據(jù)淋巴細(xì)胞百分率（%），計(jì)數(shù)淋巴細(xì)胞絕對(duì)數(shù)量（淋巴細(xì)胞數(shù)×10-3/mm3）。

酸性非特異性α-醋酸萘脂酶陽(yáng)性T淋巴細(xì)胞（ANAE+T）數(shù)量測(cè)定：于血膜頭、體、尾三部分共查計(jì)200個(gè)淋巴細(xì)胞，并用下列方法計(jì)算淋巴細(xì)胞陽(yáng)性率酸性非特異性α-醋酸萘脂酶ANAE+T數(shù)=淋巴細(xì)胞數(shù)/mm3×ANAE+T 百分率（%）。

⑷巨噬細(xì)胞吞噬率的測(cè)定： 分別于7、14、21、28、35天時(shí)每組隨機(jī)各取7只雞，編號(hào)并稱重。采用碳廓清方法，用生理鹽水1:4稀釋印度墨汁生物染色劑，按2 ml/kg體重靜注，立即計(jì)時(shí)，間隔2 min(T2）、10 min（T10）分別從對(duì)側(cè)翅靜脈采血20 μl， 加 到 2 ml 0.1%Na2CO3 溶 液 中搖勻，用721型分光光度計(jì)于600 nm波長(zhǎng)處比色，測(cè)定光密度OD值（以下分別用OD2和OD10來表示2 min和10 min所取血樣的光密度，用0.1%Na2CO3溶液做空白對(duì)照。然后處死雞，取肝臟和脾臟稱重，按如下公式計(jì)算碳廓清指數(shù)K值和吞噬指數(shù)a值。

碳廓清指數(shù) K=（lgOD2～ lgOD10）/（T10～ T2）=（lgOD2～lgOD10)/8。

吞噬指數(shù)a=體重/（肝重+脾重）×K1/3。

二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

從表2可見，復(fù)方中藥應(yīng)用于雛雞后，7～21 d用藥組與對(duì)照組相比，體重有所提高，但差異不顯著；在28～35 d天，雛雞體重明顯高于對(duì)照組（P<0.05）。

從表3可見，復(fù)方中藥應(yīng)用雛雞后，脾臟指數(shù)在35 d明顯高于對(duì)照組（P<0.01），法氏囊指數(shù)在28～35 d明顯高于對(duì)照組（P<0.01或P<0.05），脾臟指數(shù)在28～35 d明顯高于對(duì)照組（P<0.01）。

從表4可見，復(fù)方中藥應(yīng)用雛于雞后，7～21 d實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比巨噬細(xì)胞吞噬率有所提高，差異不顯著（P﹥0.05），28～35 d實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比巨噬細(xì)胞吞噬率顯著升高（P<0.01或P<0.05）。

從表5可見，復(fù)方中藥應(yīng)用于雛雞后，7～14 d實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比外周血液白細(xì)胞數(shù)量有所提高但差異不顯著，21～35 d實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比外周血液白細(xì)胞數(shù)量明顯升高，差異顯著（P<0.05）。

從表6可見，復(fù)方中藥應(yīng)用于雛雞后，7～14 d實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比外周血液淋巴細(xì)胞數(shù)量有所提高差異不顯著，21～35 d實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比外周血液淋巴細(xì)胞數(shù)量明顯升高，差異顯著（P<0.05）。

從表7可見，復(fù)方中藥應(yīng)用雛雞后，7～14 d實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比外周血液T淋巴細(xì)胞數(shù)量有所提高但差異不顯著，21 d實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比外周血液T淋巴細(xì)胞數(shù)量明顯升高，差異顯著（P<0.05），28～35 d實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比外周血液T淋巴細(xì)胞數(shù)量差異極其顯著（P<0.01）。

表1 不同日齡雛雞的飲水量

表2 復(fù)方中藥對(duì)雛雞體重的變化（ ±S d，n=7）單位：g/只

表2 復(fù)方中藥對(duì)雛雞體重的變化（ ±S d，n=7）單位：g/只

注：字母不相同者差異顯著，小寫字母P<0.01，大寫字母P<0.05，無標(biāo)記或無字母者差異不顯著P﹥0.05，以下各表同。

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表3 復(fù)方中藥多糖對(duì)雛雞免疫器官指數(shù)的影響（±S d，n=7）

表3 復(fù)方中藥多糖對(duì)雛雞免疫器官指數(shù)的影響（±S d，n=7）

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表4 復(fù)方中藥多糖對(duì)雛雞巨噬細(xì)胞吞噬率的影響（±S d，n=7）

表4 復(fù)方中藥多糖對(duì)雛雞巨噬細(xì)胞吞噬率的影響（±S d，n=7）

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表5 外周血液白細(xì)胞數(shù)量的動(dòng)態(tài)變化（±S d，n=7） 單位：細(xì)胞數(shù)（n）×10-3/mm3

表5 外周血液白細(xì)胞數(shù)量的動(dòng)態(tài)變化（±S d，n=7） 單位：細(xì)胞數(shù)（n）×10-3/mm3

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表6 外周血液淋巴細(xì)胞數(shù)量的動(dòng)態(tài)變化（±S d，n=7） 單位：細(xì)胞數(shù)（n）×10-3/mm3

表6 外周血液淋巴細(xì)胞數(shù)量的動(dòng)態(tài)變化（±S d，n=7） 單位：細(xì)胞數(shù)（n）×10-3/mm3

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表7 外周血液T淋巴細(xì)胞數(shù)量的動(dòng)態(tài)變化（±S d，n=7）單位：細(xì)胞數(shù)（n）×10-3/mm3

表7 外周血液T淋巴細(xì)胞數(shù)量的動(dòng)態(tài)變化（±S d，n=7）單位：細(xì)胞數(shù)（n）×10-3/mm3

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三、討論

1.復(fù)方中藥對(duì)雛雞免疫器官的影響。胸腺、脾臟和法氏囊是禽類的重要免疫器官。胸腺是重要的中樞免疫器官，游走的造血干細(xì)胞進(jìn)入胸腺原基，在此分化增殖成T淋巴細(xì)胞，與細(xì)胞免疫有關(guān)。脾臟是機(jī)體內(nèi)最大的外周免疫器官，免疫活性細(xì)胞在此進(jìn)一步增殖、分化和成熟，是產(chǎn)生致敏淋巴細(xì)胞和抗體的場(chǎng)所之一，并能清除衰老細(xì)胞和微生物等物質(zhì)。脾臟有T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞，還有巨噬細(xì)胞，與體液免疫和細(xì)胞免疫均有密切關(guān)系。法氏囊是中樞免疫器官，是B細(xì)胞分化成熟的場(chǎng)所。中草藥對(duì)免疫器官發(fā)育的影響主要集中在胸腺、脾臟和法氏囊，免疫器官的重量增加是生長(zhǎng)發(fā)育快的表現(xiàn)，而指數(shù)的提高意味著免疫系統(tǒng)成熟較快。楊鐵虹等報(bào)道當(dāng)歸多糖對(duì)小鼠免疫功能的影響，在10～100 mg/kg劑量范圍內(nèi)，當(dāng)歸多糖能增加正常小鼠脾重。程相朝等報(bào)道了日糧中添加人參、黃芪、黨參，結(jié)果實(shí)驗(yàn)組肉仔雞脾臟、胸腺重量和指數(shù)均高于對(duì)照組。李諾等報(bào)道了飼喂黃芪組雞的免疫器官指數(shù)比對(duì)照組和其他各實(shí)驗(yàn)組均高，特別是法氏囊指數(shù)最高。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，復(fù)方中藥多糖能提高雛雞脾臟、胸腺和法氏囊指數(shù)。脾臟指數(shù)在35 d有明顯的提高，差異極其顯著（p﹤0.01）；法氏囊指數(shù)在28日齡表現(xiàn)為差異顯著（p﹤0.05），35日齡差異極其顯著（p﹤0.01）；胸腺指數(shù)在28、35日齡表現(xiàn)差異極其顯著（p﹤0.01）。本復(fù)方中藥能促進(jìn)正常雛雞法氏囊、脾臟、胸腺的發(fā)育，其相對(duì)重量明顯增加，說明復(fù)方中藥多糖能夠促進(jìn)雛雞免疫器官的生長(zhǎng)發(fā)育和迅速成熟，從而使雛雞整體免疫機(jī)能加強(qiáng)，抵抗各種病原微生物感染和抗各種應(yīng)激的能力得到提高。

2.復(fù)方中藥多糖對(duì)雛雞非特異性免疫功能的影響。白細(xì)胞的主要功能是消滅侵入機(jī)體的外來異物，即免疫功能。白細(xì)胞是機(jī)體抵御病原微生物等異物入侵的主要防線，具有參與細(xì)胞免疫、吞噬、產(chǎn)生抗體、傳遞免疫信息等功能，白細(xì)胞的總數(shù)直接反映機(jī)體的狀態(tài)。白細(xì)胞數(shù)量的變化，可以表明它的細(xì)胞免疫水平的高低。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，復(fù)方中藥應(yīng)用后，雛雞白細(xì)胞總數(shù)在21～35日齡明顯高于對(duì)照組（P<0.05），從而使雛雞的抵抗力增強(qiáng)。說明復(fù)方中藥具有提高雛雞非特異性免疫功能的作用。

巨噬細(xì)胞是機(jī)體重要的免疫調(diào)節(jié)和效應(yīng)細(xì)胞，參與機(jī)體眾多的生理和病理反應(yīng)過程。巨噬細(xì)胞的吞噬能力是衡量機(jī)體非特異免疫功能的標(biāo)志之一，當(dāng)細(xì)菌、異物等抗原性物質(zhì)進(jìn)入機(jī)體后可迅速被單核巨噬系統(tǒng)吞噬和清除，因而，腹腔巨噬細(xì)胞吞噬率的大小可以反映其功能的強(qiáng)弱。本實(shí)驗(yàn)利用印度墨汁作為一種異物注入雛雞靜脈，通過對(duì)炭粒廓清指數(shù)的影響，反映巨噬細(xì)胞吞噬功能的強(qiáng)弱。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，免疫后28日齡復(fù)方中藥組雛雞與對(duì)照組相比吞噬細(xì)胞吞噬率提高極顯著（P﹤0.01），免疫后35日齡復(fù)方中藥組雛雞與對(duì)照組相比巨噬細(xì)胞吞噬率提高顯著（P﹤0.05）。本復(fù)方中藥具有對(duì)單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)的免疫促進(jìn)作用，能非特異性地吞噬侵入動(dòng)物體內(nèi)的病原體和有害異物，而且能將抗原提呈給T、B淋巴細(xì)胞，從而參與機(jī)體的特異性免疫應(yīng)答，是參與機(jī)體非特異性免疫的重要部分，并能參與機(jī)體的特異性免疫。

3.復(fù)方中藥多糖對(duì)雛雞細(xì)胞免疫功能的影響。細(xì)胞免疫是T細(xì)胞介導(dǎo)的機(jī)體的一種重要免疫反應(yīng)。細(xì)胞免疫是機(jī)體抵抗細(xì)胞內(nèi)微生物（如病毒）和宿主細(xì)胞內(nèi)增生的細(xì)菌感染的防御機(jī)制，可通過促進(jìn)在細(xì)胞內(nèi)將微生物破壞或溶解感染的細(xì)胞來執(zhí)行。淋巴細(xì)胞的多少是機(jī)體全身免疫機(jī)能強(qiáng)弱的一個(gè)具體表現(xiàn)。病理情況下，外周血液中的T、B細(xì)胞數(shù)量發(fā)生改變，其變化與免疫器官組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)和機(jī)能狀態(tài)密切相關(guān)，是機(jī)體免疫水平的重要標(biāo)志。

本實(shí)驗(yàn)中復(fù)方中藥應(yīng)用后，雛雞淋巴細(xì)胞數(shù)量在21～35日齡顯著高于對(duì)照組（P<0.05）。實(shí)驗(yàn)通過ANAE法測(cè)定T淋巴細(xì)胞百分率，結(jié)果表明，在21日齡明顯高于對(duì)照組（P<0.05），28～35日齡與對(duì)照組相比，差異極其顯著（P<0.01）。復(fù)方中藥能顯著提高T淋巴細(xì)胞百分率，說明中藥復(fù)方具有增強(qiáng)細(xì)胞免疫功能，除能產(chǎn)生更多的淋巴因子提高機(jī)體免疫力外，還具有輔助體液免疫的作用。復(fù)方中藥中的黃芪、黨參等含有豐富的多糖、黃酮、皂甙類等生物有效成分，這些物質(zhì)對(duì)提高雞免疫功能有促進(jìn)作用，可以活化抗體免疫系統(tǒng)和免疫器官，提高淋巴細(xì)胞功能，促進(jìn)抗體生成等多種功效。

（略）