李先軍，李 強，杜 超，王樹艷

（1.承德醫(yī)學院，河北承德 067000；2.承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院）

Bt野生菌Q1殺蟲晶體蛋白及基因型分析

李先軍1，李 強1，杜 超1，王樹艷2

（1.承德醫(yī)學院，河北承德 067000；2.承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院）

目的:分析我國千山地區(qū)森林地帶土壤中分離的野生菌Q1的32類殺蟲晶體蛋白基因類型和表達蛋白。方法:利用PCR-RFLP鑒定體系和SDS-PAGE蛋白分析方法，以JM110為受體菌、PMD-18T為克隆載體對cry7基因的同源區(qū)段進行克隆測序。結(jié)果:Q1同時含有cry1、cry7、cry16基因，同時表達了130kD、90kD和60kD蛋白。電鏡觀察顯示晶體形狀多為菱形或長菱形。測序后與模式基因比對相似性均在89%以上。結(jié)論:該實驗為克隆cry7全長基因奠定了研究基礎(chǔ)，豐富了菌株及基因資源，在資源積累方面具有重要意義。

蘇云金芽孢桿菌；殺蟲晶體蛋白；cry基因；RCR-RFLP

蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis，簡稱Bt)是目前害蟲生物防治、植物抗蟲育種中研究較為深入，應(yīng)用較為廣泛，經(jīng)濟效益、生態(tài)效益和社會效益較明顯的一類微生物。研究表明，Bt菌株的殺蟲活性與其攜帶的編碼ICP的cry基因密切相關(guān)，其殺蟲活性范圍已從鱗翅目擴大到雙翅目、鞘翅目、直翅目和膜翅目等9個目的昆蟲。由于對人畜無害，不污染環(huán)境，是目前世界各國害蟲防治的重要手段之一，已廣泛應(yīng)用于農(nóng)、林、衛(wèi)生害蟲的生物防治。因此，篩選高效、廣譜、新型Bt殺蟲菌株，以及發(fā)現(xiàn)新殺蟲毒素蛋白基因均有著十分重要的理論意義和實踐價值[1]。1996年Cuo和Chak將PCR-RFLP(又稱CAPS)新技術(shù)應(yīng)用于Bt cryl類基因的鑒定；1997年宋福平等在國內(nèi)建立了cry2-cry11等Bt常見基因類型的CAPS鑒定體系[2]。目前PCR-RFLP技術(shù)已經(jīng)被國內(nèi)外許多學者用于Bt菌株cry基因鑒定和殺蟲活性預(yù)測，且該體系鑒定范圍已擴大到cry2-cry40型基因。本研究應(yīng)用PCRRFLP技術(shù)，對我國千山地區(qū)不同森林地帶土壤中分離的野生菌株Q1 cry基因型進行了分析，同時研究了各基因編碼的晶體蛋白的表達。

1 材料與方法

1.1 菌株來源及分離 從我國千山地區(qū)自然保護區(qū)森林地帶土壤中分離得到野生菌Q1，采用醋酸鈉選擇性篩選法和抗生素選擇性篩選法。

1.2 質(zhì)粒提取及電泳 參照文獻[3]提取Bt質(zhì)粒DNA，0.7%瓊脂糖凝膠，1×TAE電泳緩沖液，4V/cm電泳6h。

1.3 PCR-RFLP分析 分別用27對引物鑒定Bt菌株的32類基因型[1-5]。

1.4 殺蟲晶體蛋白SDS-PAGE分析 參照薩姆布魯克等的《分子克隆實驗指南》操作[4]。

1.5 殺蟲晶體蛋白透射電鏡觀察 釋放晶體的Bt樣品從培養(yǎng)基上刮下，滅菌水洗2次，4%戊二醛(0.025mol/ L磷酸緩沖液，pH7.0）和1%鋨酸(相同緩沖液)固定，Epon812包埋，LKB-V超薄切片機金剛刀超薄切片，醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛各染色5min，Hitachi S-4100透射電鏡觀察并攝片。

1.6 cry7基因同源區(qū)段的PCR和克隆 以Q1菌株質(zhì)粒DNA為模板，利用Taq DNA聚合酶進行PCR擴增。回收PCR產(chǎn)物，與pMD18-T進行連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，藍白斑篩選陽性克隆，再進行PCR和限制性酶切鑒定[6]。

1.7 同源區(qū)段測序 由上海生工生物工程技術(shù)公司完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 Bt菌株cry基因型鑒定 采用PCR-RFLP方法，對野生菌Q1進行了殺蟲晶體蛋白cry基因型鑒定，結(jié)果見表1，圖1-2。表明，1號菌株同時含有cry1、cry7、cry16類基因。

表1 蘇云金芽孢桿菌基因型鑒定結(jié)果

圖1 Q1菌株部分cry型基因PCR擴增產(chǎn)物圖譜

圖2 Q1菌株cry型基因RFLP鑒定圖譜

2.2 殺蟲晶體蛋白SDS-PAGE分析 結(jié)果見表1、圖3。野生菌Q1表達130kD，90kD，60kD的蛋白。文獻表明，大部分cry1型基因表達130kD蛋白，cry2型基因表達60kD蛋白；基因型鑒定結(jié)果野生菌Q1并不含有cry2型基因，加之90kD的蛋白比較少見，推測野生菌Q1可能含有其它類型的cry基因。

圖3 Q1菌株晶體蛋白SDS-PAGE分析圖譜

2.3 殺蟲晶體蛋白透射電鏡分析 見圖4。透射電鏡結(jié)果顯示野生菌Q1的ICPs蛋白晶體形狀呈菱形(E）或長菱形(B)，D為菱形棱角被消化的現(xiàn)象。

圖4 Q1菌株晶體蛋白形態(tài)

2.4 cry7同源區(qū)段的克隆 野生菌Q1 cry7同源區(qū)段840bp的PCR高保真產(chǎn)物連接T載體后，轉(zhuǎn)入E.coli JM110，克隆并測序。陽性克隆質(zhì)粒鑒定圖譜見圖5，顯示840bp的目的片斷已被成功連接、克隆。與相關(guān)模式基因的相似性見表2?？纱_認為是新型cry7基因，全長基因在進一步克隆當中。

圖5 cry7陽性克隆質(zhì)粒單酶切檢測圖譜和PCR產(chǎn)物圖譜

表2 新基因與模式基因的同源性比較

3 討論

Bt菌株中殺蟲晶體蛋白的表達與相應(yīng)基因的存在有著一定的對應(yīng)關(guān)系，一般cry1型基因表達130kD蛋白，cry2型基因達60kDa蛋白。但也存在個別現(xiàn)象，Q1菌株雖表達130kD、60kD的蛋白，從基因鑒定和蛋白分析結(jié)果可見，Q1菌株只鑒定出cry1型基因并不含有cry2型基因；cry7的同源區(qū)段已被克隆，可確認為是新型cry7基因，全長基因在進一步克隆當中[7-8]。

透射電鏡可以清晰顯現(xiàn)晶體形狀，是一種研究晶體形狀的可靠方法。研究發(fā)現(xiàn)，野生菌Q1的ICPs蛋白晶體形狀呈現(xiàn)長菱形或菱形；且有些照片顯示不規(guī)則的菱形晶體，可能是由于晶體被蛋白酶少量降解，棱角被鈍化和切片位置不同造成。

[2]李長友.我國不同森林立地帶Bt分離株殺蟲晶體蛋白及基因分析[J].林業(yè)科學，2002，38(3)：102-105.

[3]Cherif A,Rezgui W,Raddadi N,et al.Characterization and partial purification of entomocin 110,a newly identified bacteriocin from Bacillus thuringiensis subsp.Entomocidus HD110[J]. Microbiol Res,2008.163(6):684-692.

[4]薩姆布魯克.E.F，弗里奇 T.分子克隆實驗指南[M].北京：科學出版社，1992.304.

[5]Sauka DH,Cozzi JG,Benintende GB. Detection and identification of cry1I genes in Bacillus thuringiensis using polymerase chain reaction and restriction fragment length polymorphism analysis [J]. Curr Microbiol,2006,52(1):60-63.

[6]Gaviria Rivera AM,Priest FG.Molecular typing of Bacillus thuringiensis serovars by RAPD-PCR [J].Syst Appl Microbiol, 2003,26(2):254-261.

[7]Sauka DH, Cozzi JG, Benintende GB. Screening of cry2 genes in Bacillus thuringiensis isolates from Argentina [J].Antonie Van Leeuwenhoek,2005,88(2):163-165.

[8]Juárez-Pérez V,Porcar M,Orduz S,et al.Cry29A and Cry30A: two novel delta-endotoxins isolated from Bacillus thuringiensis serovar Medellin [J].Syst Appl Microbiol,2003,26(4):502-504.

ANALYSIS OF INSECTICIDAL CRYSTAL PROTEIN AND ITS CRY-TYPE GENES OF BACILLUS THURINGIENSIS

LI Xian-jun, LI Qiang, DU Chao, et al
(Chengde Medical College, Hebei Chengde 067000, China)

Objective:To analyze the gene type and expressed proteins of 32 kinds insecticidal crystal protein in Bacillus thuringiensis wild strain Q1 isolated from forest soil of Qianshan area.Methods:PCR-RFLP identification systemand SDS-PAGE protein analytical method were used in this study. The homologous sequence of cry7 gene was cloned and sequenced taken JM110 as recipient bacterium and PMD-18T as cloning vector.Results:Q1 contained three cry-type genes: cry1, cry7 and cry16, and encoded 130,90,60 kD protein at the same time. The electron microscope showed rhombus shape crystal. Compared with model gene, cry7 homologous sequence homology was more than 89%.Conclusions:This research enriches strains and genetic resources, and has important significance in accumulation of resources.

Bacillus thuringiensis; Insecticidal crystal protein; Cry gene; PCR-RFLP

Q785

A

1004-6879(2011）02-0124-03

2010-12-17）