胡曉航，王皙瑋，吳玉梅，周 芹，許慶軒

（1.黑龍江省普通高等學(xué)校甜菜遺傳育種重點實驗室，哈爾濱150080；2.農(nóng)業(yè)部甜菜品質(zhì)監(jiān)督檢驗測試中心，哈爾濱150080；3.黑龍江大學(xué)農(nóng)作物研究院，哈爾濱150080）

酶聯(lián)免疫法測定土壤中莠去津

胡曉航1,2,3，王皙瑋1,2,3，吳玉梅1,2,3，周 芹1,2,3，許慶軒1,2,3

（1.黑龍江省普通高等學(xué)校甜菜遺傳育種重點實驗室，哈爾濱150080；2.農(nóng)業(yè)部甜菜品質(zhì)監(jiān)督檢驗測試中心，哈爾濱150080；3.黑龍江大學(xué)農(nóng)作物研究院，哈爾濱150080）

用定量酶聯(lián)免疫法對土壤中莠去津的殘留進行初篩，然后對陽性樣品用氣相色譜-質(zhì)譜法進行確證，并對兩種方法的回收率、精密度及檢測限進行評價。向土壤樣品中分別添加0.3、1.0、3.0μg/kg濃度水平的莠去津標(biāo)準(zhǔn)品時，ELISA的平均回收率為92.20%～97.14%，變異系數(shù)為1.69%～4.11%，檢測限為0.04μg/kg；GC-MS的平均回收率為85.46%～87.68%，變異系數(shù)為2.93%～4.05%，檢測限為0.03μg/kg。對酶聯(lián)免疫試劑盒篩選的3個陽性樣品用GC-MS進行確證，測定結(jié)果基本一致，結(jié)果滿意。研究表明酶聯(lián)免疫法重復(fù)性好、準(zhǔn)確度較高，是一種土壤中莠去津殘留的快速篩選方法。

土壤；莠去津；酶聯(lián)免疫法；氣相色譜-質(zhì)譜法

莠去津是一種三嗪除草劑，又名阿特拉津，化學(xué)名稱為2-氯-4乙氨基-6-異丙氨基1，3，5三嗪，結(jié)構(gòu)式見圖1。分子量為215.7，熔點為175～177℃，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定[1]，作為除草劑，莠去津持效期長，對下茬敏感作物的殘留藥害問題影響大。近年來，莠去津在環(huán)境中的殘留不斷被檢測到，從而日益引起學(xué)術(shù)界和公眾對環(huán)境污染和防治的廣泛關(guān)注。目前，土壤中莠去津的殘留分析采用的分析方法主要是高效液相色譜-質(zhì)譜、液相色譜/紫外檢測器、氣相色譜-質(zhì)譜、氣相色譜/氮磷檢測器、氣相色譜/電子捕獲檢測器檢測[2-5]及酶聯(lián)免疫分析技術(shù)法[6]。酶聯(lián)免疫法作為一種篩選方法已經(jīng)受到廣泛重視。本實驗運用酶聯(lián)免疫法和氣相色譜-質(zhì)譜法對甜菜地中受莠去津殘留危害的土壤進行測定，并對兩種方法的回收率、精密度及檢測限進行評價。

1 材料與方法

1.1材料、試劑和儀器

1.1.1 樣品及其制備實驗所用受害土壤經(jīng)風(fēng)干研磨，粉末狀。

1.1.2 試劑莠去津標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99%，德國Dr ehrenstorfer），Atrazine ELISA(BRAXIS，Microtiter Plate)試劑盒（其中包括96微孔，6種濃度的Atrazine標(biāo)準(zhǔn)溶液，酶結(jié)合物，抗體，樣品稀釋液，顯色液TMB，終止液，檢測緩沖液，洗滌緩沖液），丙酮（Fisher色譜純），正己烷（色譜純），乙腈（Fisher色譜純），甲醇（DIKMA色譜純），NaCl（優(yōu)級純）。

1.1.3 儀器Agilent 7890/5975-MSD氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，配備CTC-PAL自動進樣器，Agilent 19091s-433毛細(xì)管柱（30m×250μm×0.25μm）；KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗器（產(chǎn)地昆山市）；凈化小柱Agela technologies Cleanert-Florisil-SPE(1000mg/6mL)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（英國RE300）；酶標(biāo)分析儀（DNM-9602G北京普朗）；電腦洗板機（DNX-9620北京普朗）

1.2方法

1.2.1 樣品前處理方法(1)ELISA法在一個60mL的離心管中，稱取10g土壤樣品（去除水分），加入30樣品提取液（22.5 mL甲醇+7.5 mL水），劇烈震蕩混勻，低速離心3000r/min，30min，然后放置過夜。取1mL上清用樣品稀釋液50倍稀釋。(2)GC-MS法柱子活化，預(yù)先用5 m L正己烷+丙酮（9∶1）、5 mL正己烷淋洗Florisil-SPE萃取小柱，棄去淋洗液。稱取5g土樣，加入乙腈+水（5∶1）30 mL，超聲20min，轉(zhuǎn)移至裝有NaCl的具塞量筒中，劇烈震蕩，靜止15min，取乙腈層15mL，70℃旋蒸近干，用2mL正己烷溶解，轉(zhuǎn)移至Florisil-SPE萃取小柱，棄去淋出液，用5mL正己烷+丙酮（9∶1）淋洗萃取小柱兩次，收集兩次淋洗液，40℃旋蒸近干，加入1 mL正己烷定容，等待上機。

1.2.2 氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）儀器條件Agilent毛細(xì)管柱19091S-433（30m×0.25mm i.d.×0.25μm），柱初始溫度為60℃，保持1min，以15℃/min的速度升到250℃，保持4min不分流進樣，進樣量1μL，載氣為高純氦氣，流速1.1Ml/min，進樣口溫度為260℃，GC-MS接口溫度280℃，離子源溫度230度，EI電子能量70eV，溶劑延遲時間1.7min，定量離子200掃描方式為全離子掃描。

1.2.3 ELISA分析步驟將標(biāo)準(zhǔn)品和樣品所用的微孔條插入微孔架，記錄標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的位置。用多道移液器在每個微孔中加入25μL檢測緩沖液，在對應(yīng)的微孔中加入100μL標(biāo)準(zhǔn)品或樣品，再加入50μL酶結(jié)合物，在室溫下孵育30min。倒出孔中液體，將微孔架倒置在吸水紙上拍打3次以保證完全除去孔中液體，每個微孔至少加入250μL，1×洗滌緩沖液，再倒掉孔中液體，重復(fù)操作3次。在每個孔中加入100μL顯色劑，室溫孵育20min。加入50μL終止液，30min后以各自空白為空白，在450nm下讀取每個孔的吸光度值（OD）。

1.2.4 ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作及樣品濃度計算將所獲得的標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的吸光度按下式折算成百分比吸光度B/B0（%）：用Excel繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計算出樣品中莠去津的濃度。

1.2.5 精密度和準(zhǔn)確度向土壤樣品中添加0.3、1.0、3.0μg/kg3個濃度水平的莠去津標(biāo)樣，每個濃度做5次平行，同時做3個空白樣。按照1.2.1的方法分別進行前處理，并用酶聯(lián)免疫法和氣相色譜-質(zhì)譜法測定甜菜地土壤中莠去津的含量，計算回收率，變異系數(shù)(RSD%)。

2 結(jié)果與分析

2.1 莠去津的質(zhì)譜圖莠去津標(biāo)準(zhǔn)品一級質(zhì)譜圖見圖2，分子量215，定量離子200。

圖1 莠去津的結(jié)構(gòu)式

圖2 莠去津的一級質(zhì)譜圖

2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2.1 ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線按照1.2.3步驟，分別測定濃度為0、0.05、0.1、0.25、1.0、2.5、5.0μg/L莠去津標(biāo)準(zhǔn)液的吸光度，采用Excel建立標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖3

2.2.2 GC-MS標(biāo)準(zhǔn)曲線取0.1、0.2、0.5、1.0、3.0、5.0μg/L的莠去津標(biāo)準(zhǔn)液經(jīng)GC-MS分析得出標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖4。

圖3 ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖4 GC-MS標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3精密度和準(zhǔn)確度、檢測限

實驗的準(zhǔn)確度以回收率表示，精密度以變異系數(shù)來表示，ELISA和GC-MS測定結(jié)果見表1。從表中可以看出，向土壤樣品中分別添加0.3、1.0、3.0μg/kg濃度水平的莠去津標(biāo)準(zhǔn)品時，ELISA的平均回收率為92.2%～97.14%，變異系數(shù)為1.69%～4.11%；GC-MS的平均回收率為85.46%～87.68%，變異系數(shù)為2.93%～4.05%。GC-MS中以標(biāo)準(zhǔn)曲線中最低濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度(0.1μg/L)定量色譜圖的3倍信噪比計算檢測限為0.03μg/kg。ELISA同時測定6個“0”標(biāo)準(zhǔn)液的吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出對應(yīng)于吸光度的各濃度，按照95置信度計算檢測限為0.04μg/kg。

2.4酶聯(lián)免疫法和GC-MS法檢測陽性樣品的確證試驗對酶聯(lián)免疫試劑盒篩選的3個陽性樣品用GC-MS進行確證，測定結(jié)果與試劑和方法一致，結(jié)果滿意，見表。

表1 ELISA與GC-MS法測定結(jié)果及加標(biāo)回收率

3 結(jié)論

本實驗采用酶聯(lián)免疫法和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測定土壤中莠去津的殘留，進行加標(biāo)回收率試驗，0.3μg/kg加標(biāo)水平的回收率分別為92.20%和86.02%，變異系數(shù)分別為1.69%和3.96%，前者適用于土壤中莠去津殘留的篩選，后者適用于陽性樣品的確證和精確定量。

[1]王煥民，張子明.新編農(nóng)藥手冊[M].北京：農(nóng)業(yè)出版社，1989.

[2]喬雄梧，馬利平.土壤中殘留的莠去津及其代謝產(chǎn)物的高效液相色譜和氣-質(zhì)譜聯(lián)用分析[J].色譜，1995，13(3)：170-173.

[3]任晉，蔣可，徐曉白.土壤中莠去津及其降解產(chǎn)物的提取及高效液相色譜-質(zhì)譜分析[J].色譜，2004，22(2)：147-150.

[4]李衛(wèi)建，聶志強，蔡彥明，等.氣相色譜法同時測定土壤中13種三嗪類除草劑殘留量的方法研究[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報，2009，28(1)：211-215.

[5]Lucio FCMelo,CarolHCollins,IsabelCSFJardim.High-performance liquid chromatographic determination ofpesticidesin tomatoesusing laboratory-madeNH2and C18solid-phaseextractionmaterials[J].JournalofChromatography A,2005,1073(1-2):75-81.

[6]鄧安平，F(xiàn)ranek Milan.酶聯(lián)免疫吸附分析法測定水樣中的阿特拉津[J].分析化學(xué)，1998，26（1）：29-33.

[7]Irena Baranowska,Hanna Barchanska,Ramadan A.Abuknesha,Robert G.Price,Agata Stalmacha.ELISA and HPLCmethods foratrazineand simazine determination in trophic chainssamp les[J].Ecotoxicologyand EnvironmentalSafety,2008,70(2):341-348.

Determ ination of Residual Herbicide Atrazine in Soilby ELISA

HUXiao-hang1,2,3,WANG Xi-wei1,2,3,WU Yu-mei1,2,3,ZHOUQin1,2,3,XUQing-xuan1,2,3
(1.Key Laboratory ofSugarbeetGenetic Breeding,HeilongjiangUniversity,Harbin 150080,China; 2.Center for theControlofSugarbeetQuality,Ministry ofAgriculture,P.R.ChinaHarbin 150080,China；3.Institute forCrop Research,Heilongjiang University,Harbin 150080,China)

The residuesofherbicide Atrazinewere determined in the soil.The initialscreeningwas done by ELISA, and the positive sampleswere confirmed by GC-MS(gas chromatography-mass-spectrography),then to evaluate the recovery,accuracy and LOD(limitofdetection)of towmethods.0.3，1.0，3.0μg/kg Atrazine ofstandard substancewas added to samples of soil,mean recovery from the ELISAmethod was 92.2%-97.14%,relative standard deviation was 1.69%-4.11%,LOD was 0.04μg/kg;mean recovery from the GC-MSmethod was 85.46%-87.68%,relative standard deviation was 2.93%-4.05%,LOD was 0.03μg/kg.The determined result of the GC-MSmethod was basically consistentwith thatofELISAmethod.The resultsshowed that the ELISAmethod to determine Atrazineof soil is fast, accurateand repeatable.

soil;Atrazine;ELISA;GC-MS

S

A

1007-2624（2011）01-0028-03

2010-10-21

中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費專項基金資助項目（0032010056）。

胡曉航(1980-)，女，助理研究員，主要從事甜菜及土壤品質(zhì)及農(nóng)藥殘留檢測技術(shù)研究。E-mail：hxhlmz@163.com

吳玉梅，研究員，E-mail：zjzxwym@163.com