王曉霞綜述 趙 明審校

糖尿病內(nèi)皮祖細(xì)胞的研究

王曉霞1綜述 趙 明2審校

本文2010—12—20收到，2011—02—18修回，2011—02—23接受

自1997年Asahara從人外周血單個核細(xì)胞首次分離出內(nèi)皮祖細(xì)胞（Endothelial Progenitor Cells，EPCs）［1］以來，人們對其進行了大量研究。結(jié)果表明，EPCs是具有遷移、增殖、粘附和分化成內(nèi)皮細(xì)胞功能的前體細(xì)胞，不僅參與胚胎期血管的形成，也參與成人新生血管的發(fā)生。目前把表達CD34和血管內(nèi)皮生長因子受體（KDR）的細(xì)胞定義為 EPCs（CD34＋KDR＋）［2］。有報道稱1 型糖尿病（Type 1 Diabetes Mellitus，T1DM）及2型糖尿病（Type 2 Diabetes Mellitus，T2DM）患者外周血中存在EPCs數(shù)量減少及功能障礙［1］。深入研究EPCs在糖尿病，尤其在伴發(fā)血管病變中的重要作用，對于認(rèn)識EPCs作為糖尿病血管病變的一種新的發(fā)生機制及使其成為潛在的治療靶點具有重要意義。

1 EPCs概述

骨髓、臍血、外周血均含有EPCs，且三者之比約為15∶10∶1［3］。將外周血單個核細(xì)胞接種于纖維連接蛋白包被的培養(yǎng)板上，培養(yǎng)至第4天時，培養(yǎng)板上出現(xiàn)呈紡錘體形狀的貼壁細(xì)胞，稱為早期EPCs；7～14天時部分貼壁細(xì)胞形態(tài)呈鵝卵石樣改變，類似于成熟的內(nèi)皮細(xì)胞，稱為晚期EPCs。早期EPCs表達CD14、CD45，高表達血管內(nèi)皮生長因子（Vas-cular Endothelial Growth Factor，VEGF）、白細(xì)胞介素-8（In-terleukin，IL-8）、粒細(xì)胞集落刺激因子（Granulocyte Colony—Stimulating Factor，G-GSF）。免疫 組 化 鑒定提示，晚 期EPCs主要表達成熟內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物血小板內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子 （Platelet／endothelial Cell Dhesion Molecule-1，PECAM-1）、血管性假血友病因子（von Willebrand Factor，v WF）、血管內(nèi)皮細(xì)胞鈣粘蛋白（Vascular Endothelial Cadherin，VEC）、內(nèi)皮細(xì)胞氮氧化物合酶（Endothelial Nitric Oxide Synthase，eNOS），且增殖能力較早期EPCs更強，體外生存時間也更長，具有形成血管樣結(jié)構(gòu)的能力［4］。此外，晚期EPCs還表達CD34、KDR及AC133，但對AC133的表達不同于造血祖細(xì)胞和白細(xì)胞，因為它很快就消失了，現(xiàn)在體外研究的EPCs主要表達CD34及KDR（CD34＋KDR＋）。

2 糖尿病患者外周血EPCs的變化及機制

2.1 血糖水平對EPCs的影響

Churdchomjan等［5］采用不同濃度的葡萄糖（7.8、10.5、13.5、16.5、19.5mmol／L）干預(yù)外周血來源的 EPCs不同時間，觀察EPCs的數(shù)量（7天）、增殖能力（14、21天）及凋亡情況（7、14天），結(jié)果發(fā)現(xiàn)葡萄糖呈量效關(guān)系減少EPCs的數(shù)量（P＜0.05），呈量效和時效關(guān)系降低EPCs的增殖能力（P＜0.05），呈量效和時效關(guān)系增加EPCs的凋亡率；該研究還顯示，糖尿病患者外周血中EPCs的數(shù)量與患者空腹血糖及糖化血紅蛋白（Hb A1c）呈負(fù)相關(guān)，表現(xiàn)為EPCs數(shù)量減少，并認(rèn)為這種減少與EPCs壽命縮短或骨髓EPCs動員減少有關(guān)，其中壽命縮短可能由于細(xì)胞增殖減少和細(xì)胞死亡加速所致。研究表明，高糖條件下，靜息狀態(tài)的EPCs不斷累積時，增殖狀態(tài)的EPCs數(shù)量在不斷減少［6］，這種減少與P16及P21蛋白表達水平的上調(diào)有關(guān)。因為P16及P21均在細(xì)胞周期調(diào)控表達中起重要作用，屬于細(xì)胞周期蛋白激酶抑制蛋白，對G1／S轉(zhuǎn)換起負(fù)調(diào)節(jié)作用，而P16及P21蛋白表達水平的改變與幾種類型細(xì)胞的凋亡有關(guān)。還有研究表明，高糖能夠上調(diào)在EPCs增殖、存活及分化中起重要作用的E—Twenty six（ETS）轉(zhuǎn)錄因子，繼而增強表達非內(nèi)皮ETS靶基因基質(zhì)金屬蛋白酶類（Matrix Metalloproteinases，MMPs）及CD115，抑制表達內(nèi)皮標(biāo)志物CD105，影響EPCs向內(nèi)皮細(xì)胞的分化，致EPCs功能活動受阻［7］。也有研究認(rèn)為，高糖通過p38促分裂原活化蛋白激酶（Mitogen-Activated Protein Kinase，p38MAPk）加速EPCs衰老，且減少循環(huán)中EPCs數(shù)量［8］，而一氧化氮（NO）的供體硝普鈉（Sodium Nitroprus-side，SNP）［9］或p38MAPK阻滯劑SB230580明顯改善高糖對EPCs數(shù)量和增殖的抑制作用［5］。此外近來研究表明，磷脂酰肌醇-3激酶（Phosphatidylinositol 3’Kinase，PI3K）／絲氨酸—蘇氨酸激酶（Serine-Threonine Kinase，AKT）／eNOS［PI3K／AKT／eNOS］信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在阻止高糖致細(xì)胞損傷中也發(fā)揮重要作用，PI3K／AKT能夠阻止EPCs死亡，導(dǎo)致細(xì)胞存活及激活eNOS、增加NO產(chǎn)量。

2.2 胰島素、胰島素抵抗對EPCs的影響

體外研究表明，胰島素能夠增加培養(yǎng)基中EPCs，尤其是早期EPCs和單個核細(xì)胞的數(shù)量［10］。超生理劑量胰島素影響EPCs從骨髓動員至外周血以及降低EPCs與受損內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)合能力，取決于內(nèi)皮細(xì)胞胰島素樣生長因子（Insulin-Like Growth Factor，IGF）-1及其受體-2（IGF-R2），因IGF—1／IGF-R2是 EPCs的主要管理者［11，12］。超生理劑量胰島素甚至能夠產(chǎn)生促氧化效應(yīng)，與糖尿病患者胰島素抵抗所達到的超生理劑量的胰島素產(chǎn)生的促動脈粥樣硬化效應(yīng)可能有關(guān)［13，14］。胰島素抵抗通過減少細(xì)胞周期蛋白 E（Cyclin E）、細(xì)胞周期蛋白依賴激酶-2（cyclin dependent kinase-2，cdk-2）及增殖細(xì)胞核抗原（Proliferating Cell Nuclear Anti-gen，PCNA）的表達而減少EPCs增殖，通過過度表達caspase-3、激活細(xì)胞內(nèi)蛋白降解程序而致細(xì)胞凋亡［15］。胰島素與受體結(jié)合，通過胰島素受體底物激活PI3K途徑，直接磷酸化e NOS，使eNOS活性增強，NO產(chǎn)生增加；而胰島素抵抗通過增加內(nèi)皮細(xì)胞脂肪酸氧化而降低eNOS活性，是導(dǎo)致糖尿病患者發(fā)生動脈粥樣硬化和心血管疾病的另一種潛在機制［16］。研究表明大多數(shù)人體組織中eNOS受損與高糖及糖尿病相關(guān)，短期使用胰島素并不能逆轉(zhuǎn)eNOS磷酸化作用受損，不能增加NO產(chǎn)量，而促進EPCs動員及傷口愈合［16］。在體內(nèi)，胰島素能夠阻止細(xì)胞遷移和新生內(nèi)膜的增長，增強EPCs功能，改善動脈損傷后的再內(nèi)皮化［17］。

2.3 eNOS、MMPs對EPCs的影響

骨髓來源的EPCs在血管生成及歸巢到外周血中對傷口愈合起關(guān)鍵作用。eNOS的表達及磷酸化作用對于EPCs的存活、遷移、血管發(fā)生至關(guān)重要。骨髓中EPCs在組織缺氧所誘導(dǎo)釋放的血管內(nèi)皮生長因子A及由骨髓間質(zhì)eNOS活化而增加NO釋放的作用下動員至外周血中，隨后在缺血組織誘導(dǎo)表達的，作為EPCs歸巢的信號基質(zhì)源因子-1α（Stromal Cell-Derived Factor，SDF-1α）的趨化作用下趨化至缺血組織，參與組織水平的血管生成及傷口愈合［18］。來源于eNOS的NO可通過亞硝基化和提高組織VEGF的表達來促進EPCs的動員，VEGF還通過對AKT和e NOS 1177位點的絲氨酸磷酸化作用反饋促進EPCs的動員和血管生成［8］。骨髓eNOS活化功能受損致EPCs動員至外周血中減少可能由骨髓間質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞和淋巴細(xì)胞數(shù)量減少所致。EPCs減少能夠被高壓氧治療所逆轉(zhuǎn)［18］。MMPs是一組具有類似結(jié)構(gòu)及共同生物化學(xué)性質(zhì)的金屬依賴性蛋白水解酶超基因家族，是細(xì)胞外基質(zhì)的主要降解酶系統(tǒng)，能降解多糖以外的所有細(xì)胞外基質(zhì)成分如膠原及彈性蛋白，其活性受金屬蛋白酶組織抑制劑（Tissue Inhibitor of Metalloproteinase，TIMPs）的調(diào)節(jié)。迄今發(fā)現(xiàn)的28種 MMP中，MMP-2及MMP-9是Ⅳ型膠原酶的兩種存在形式。近來研究表明，糖尿病小鼠的組織缺血，可誘導(dǎo)VEGF、缺氧誘導(dǎo)因子-1α（Hy—poxia-Inducible Factor，HIF-1α）、白介素-1β（IL-1β）表達受損，而使 MMP-2及 MMP-9表達過度，TIMPs表達下降［19］。HIF-1α是VEGF的轉(zhuǎn)錄因子，VEGF動員EPCs從骨髓中進入外周血中，HIF-1α活化可調(diào)節(jié)VEGF的表達。正常小鼠中，VEGF、HIF-1α及其誘導(dǎo)劑IL-1β表達均顯著增加，且同時達峰值。糖尿病小鼠的VEGF表達受損與HIF-1α及IL-1β的低表達相關(guān)。其機制可能是高糖通過氧化應(yīng)激和糖基化終產(chǎn)物上調(diào)MMPs的表達［20］，或抑制NO的作用而增強MMPs的活化［21］。MMPs一方面通過使kit膜型配體變成可溶解形式，促使EPCs動員至外周血中［22］，另一方面通過自身拮抗作用拮抗VEGF的效應(yīng)［23］。

2.4 外周血管病變（Peripheral Vascular Disease，PVD）與EPCs

PVD是T2DM中一種普遍而嚴(yán)重的并發(fā)癥，T2DM的側(cè)支血管代償不足是PVD發(fā)病的原因之一。踝臂指數(shù)（Ankle Brachial Index，ABI）是下肢血管病變最客觀的診斷試驗，也是檢測心血管風(fēng)險最可靠的標(biāo)記物。EPCs進行性減少平行于T2DM外周血管病變的嚴(yán)重性，CD34＋KDR＋細(xì)胞水平負(fù)相關(guān)于ABI、下肢動脈閉塞的臨床狀態(tài)及頸動脈狹窄的最大程度［2］。EPCs的減少在PVD的病理生理中起作用，因為EPCs減少促成內(nèi)皮功能障礙，加速動脈硬化進程，導(dǎo)致血管病變，如糖尿病足部損害等［23］。研究發(fā)現(xiàn)，下肢血管缺血患者用促血管生成治療的臨床效果并不理想［24］，提示該類患者可能缺少血管生成最原始的細(xì)胞EPCs，而僅靠細(xì)胞因子是不夠的［25］。近來，局部缺血綜合癥患者應(yīng)用EPCs進行細(xì)胞治療時發(fā)現(xiàn)，骨髓來源的EPCs若其分化能力及血管形成能力受損，則不能用于血管治療［26］，但可在EPCs的體外擴增過程中進行基因轉(zhuǎn)導(dǎo)來解決EPCs的這些功能缺陷。進行表型調(diào)整的EPCs的應(yīng)用可能減少移植所需EPCs的數(shù)量，尤其對自體移植更具優(yōu)勢。

3 結(jié)語

EPCs參與出生后器官和組織的血管新生及受損血管的修復(fù)以及維持血管壁的完整性。隨著研究的不斷深入，EPCs將會在改善組織缺血與血管再生方面發(fā)揮重要作用。如應(yīng)用EPCs治療糖尿病各種血管并發(fā)癥將成為一個新的治療靶點，對增殖型視網(wǎng)膜病變通過控制局部的EPCs聚集與分化，從而減少不良血管的生成、改善愈后等，均有利于提高糖尿病患者的生存質(zhì)量。

本文作者簡介：

王曉霞（1989～），女，漢族，碩士研究生

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R587.1

A

1005—1740（2011）02—0065—03

1南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院臨床學(xué)院（南京軍區(qū)南京總醫(yī)院），郵政編碼 南京210093；2南京軍區(qū)南京總醫(yī)院干部病房2科；

趙 明，E-mail：zhao1961＠126.com