張定華 白世平 張克英 丁雪梅 吳彩梅

(四川農(nóng)業(yè)大學動物營養(yǎng)研究所,教育部抗病營養(yǎng)重點實驗室,雅安 625014)

2007年 3月,美國發(fā)生了“寵物毒糧”事件[1],2008年中國發(fā)生了“三鹿奶粉”事件,隨后在雞蛋中檢測出了三聚氰胺(MEL)。農(nóng)業(yè)部隨即組織開展了飼料中 MEL限量制定工作,中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告第 1218號規(guī)定飼料原料和飼料產(chǎn)品中 MEL的限量值為 2.5m g/kg。MEL可被某些微生物在體內(nèi)降解為三聚氰酸(CYA),加劇 MEL的毒性[2]。MEL或 CYA單獨使用對動物的毒性較小[1,3-4]。本實驗室前期研究表明,大劑量 MEL(125～2 000mg/kg)會對蛋雞的肝臟和腎臟產(chǎn)生一定損傷。MEL和 CYA合用會在貓和狗腎臟中形成不溶于水的大分子復合物,并形成晶體甚至結石,存在于腎小管中不易被排出,阻塞腎小管,最終導致腎衰竭[1,3-4]。有研究發(fā)現(xiàn),在動物腎小管中,MEL和 CYA會以 3∶1的比例形成晶體復合物[5],但 MEL與 CYA合用對蛋雞的毒性作用迄今未見報道。有關 M EL和 CYA以 3∶1的比例添加的毒性效應以及飼糧 CYA的存在是否會加劇 MEL毒性,目前在家禽上未見報道。本研究以蛋雞為試驗動物,旨在考察低劑量 MEL和CYA對蛋雞的毒性效應,為相關風險評估提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

MEL(分析純,純度≥99.5%)購自北京化學試劑公司,CYA(分析純,純度 ＞99%)購自上?？笊锛夹g有限公司。

1.2 試驗設計及飼糧

本試驗共設 7個組,每組 9個重復,每個重復2只雞。組 1為對照組,飼喂基礎飼糧,組 2～4分別飼喂在基礎飼糧中添加 MEL 5、15和 30mg/kg的飼糧,組5～7分別飼喂在組 2～4的飼糧中添加CYA 1.667、5和 10 mg/kg的飼糧,以保持 MEL和 CYA比例為 3∶1(表 1)。試驗期 35 d,1～21 d,所有組飼喂相應的試驗飼糧;22～35 d,每組中的6個重復換喂不含 MEL和 CYA的基礎飼糧,進行消除試驗,其余 3個重復仍飼喂試驗飼糧,繼續(xù)進行殘留試驗。

表 1 不同組飼糧中 MEL和 CYA的添加水平Table 1 Supp lemental levels ofmelam ine and cyanuric acid in the diets for different groups mg/kg

試驗基礎飼糧為玉米 -豆粕型飼糧,粉料,參考中國雞飼養(yǎng)標準(NY/T 33—2004)配制。飼糧組成及營養(yǎng)水平見表 2。

表 2 基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平(風干基礎)Table 2 Composition and nutrient levels of the basal diet(air-dry basis) %

1.3 試驗動物及飼養(yǎng)管理

試驗選用 126只 78周齡體重相近、產(chǎn)蛋率相近[(88.72±4.29)%]的羅曼粉殼蛋雞,在四川農(nóng)業(yè)大學動物營養(yǎng)研究所試驗場進行。采用籠養(yǎng)、舍飼。預試 1周后進入正試期。采用自然加人工光照(15 h/d),自由采食、飲水,定時清掃衛(wèi)生、噴霧消毒。

1.4 測定指標及方法

1.4.1 血清生化指標

于試驗第 21天各組分別選取接近平均體重的 4只試雞,第 28天(消除試驗第 7天)從每組做消除試驗的重復中選 4只雞,以及第 35天繼續(xù)做殘留試驗的重復中的 6只雞進行翅下靜脈采血10m L,3 500 r/min離心 15 m in,分離血清,-20℃保存。采用日立 7020全自動生化分析儀測定血清肌酐(CRE,苦味酸法)和尿酸(UA,尿酸酶法)含量及谷丙轉氨酶(ALT,酶法)和谷草轉氨酶(AST,酶法)活性。

1.4.2 腎臟組織抗氧化酶活性和丙二醛含量

將試驗第 21天、第 28天和第 35天(繼續(xù)做殘留試驗的重復)采血后的試雞頸部脫臼處死,放血。采集腎臟組織(約 0.2 g),用試劑盒(南京建成生物工程研究所)測定超氧化物歧化酶(SOD)活性、總抗氧化能力(T-AOC)和丙二醛(MDA)含量。

1.4.3 肝臟、腎臟組織切片

將試驗第 21天、第 28天和第 35天(繼續(xù)做殘留試驗的重復)的試雞屠宰后,取部分肝臟、腎臟,用中性的 4%多聚甲醛固定。將固定的標本經(jīng)水洗、透明、浸蠟、包埋等處理后,制成 5μm的切片,HE染色,在光學顯微鏡下觀察病變情況。

1.5 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)采用 SAS 8.0軟件 GLM程序進行單因素方差分析,當方差分析顯著時,用 Duncan氏法進行多重比較。以 P＜0.05為顯著性檢驗標準。

2 結 果

2.1 M EL和 CYA對蛋雞血清生化指標的影響

由表 3可知,各組 21、35 d血清 AST、ALT活性和 CRE含量無顯著差異(P＞0.05)。但 21 d時,血清 UA含量差異達到顯著水平(P＜0.05),其中 15 mg/kg MEL和 5 mg/kg CYA組、30 mg/kg MEL和 10mg/kg CYA組顯著高于 0、5和15mg/kg MEL組,而 35 d UA含量接近顯著水平(P=0.059)。

消除 7 d后,各組血清 AST和 ALT活性、UA和CRE含量無顯著影響(P＞0.05)。

2.2 MEL和 CYA對蛋雞腎臟抗氧化酶活性和丙二醛含量的影響

由表 4可知,各組 21、35 d腎臟 T-AOC、SOD活性和 MDA含量差異不顯著(P＞0.05)。28 d,各組腎臟 T-AOC、SOD的活性和 MDA含量均與對照組接近。

消除 7 d后,21和 35 d腎臟 T-AOC、SOD的活性和 MDA的含量得到了改善(P＞0.05),均接近對照組水平。

2.3 MEL和 CYA對蛋雞肝臟和腎臟組織結構的影響

21 d時,各組肝腎病變規(guī)律與 35 d相似,但35 d病變更為嚴重,因此,本文只列出 35 d病變結果。

MEL和 CYA對蛋雞肝臟組織結構的影響見圖 1。與對照組相比,單獨添加 5 mg/kg MEL組的病變不明顯(圖略),15和 30 mg/kg MEL組的肝臟輕度脂變,部分肝細胞胞漿內(nèi)有少量圓形空泡(圖 1-B、圖 1-C)。同時添加 5 mg/kg MEL和1.667mg/kg CYA組、15mg/kg MEL和 5mg/kg CYA組的病變相似,均出現(xiàn)肝細胞輕度腫脹、水泡變性和脂肪變性的癥狀(圖 1-D、圖 1-E)。添加30 mg/kg MEL和 10 mg/kg CYA組的病變最為嚴重,肝細胞排列紊亂,肝索結構不清,肝細胞漿中有較多的不規(guī)則或近圓形空泡(圖 1-F)。

圖 1 飼糧添加M EL和CYA對蛋雞肝臟組織結構的影響Fig.1 Effects of dietarymelam ine and cyanuric acid on liver structure of laying hens(400×)

MEL和 CYA對蛋雞腎臟組織結構的影響見圖 2。與對照組相比,單獨添加 5 m g/kg MEL組腎臟未見明顯病變(圖略)。15和 30mg/kg MEL組腎小管上皮細胞輕度空泡變性,后者腎小管間質(zhì)還有輕度淤血(圖 2-H和圖 2-I)。同時添加5mg/kg MEL和 1.667mg/kg CYA組、15mg/kg MEL和 5 mg/kg CYA組病變相似,均表現(xiàn)為腎小管上皮細胞腫脹、水泡變性(圖 2-J、圖 2-K)。30mg/kg MEL和 10 mg/kg CYA組病最嚴重,腎小管上皮細胞腫脹,腎小球輕度充血(圖 2-L)。

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消除 7 d后,各組肝臟和腎臟組織病變情況見圖 3。本文僅列出在 35 d時受損較嚴重的30 mg/kg MEL組、30 mg/kg MEL和 10 mg/kg CYA組經(jīng)消除試驗后的結果。由圖 3可知,這 2個組的肝臟(圖 3-B和圖 3-C)、腎臟(圖 3-E和圖 3-F)與對照組相比,均無明顯病變。

圖 2 飼糧添加M EL和CYA對蛋雞腎臟組織結構的影響Fig.2 Effects o f dietary melam ine and cyanuric acid on kidney structure of laying hens(400×)

圖 3 消除 7 d后蛋雞肝臟和腎臟的組織結構Fig.3 Structures of liver and kidney of laying hens after elim ination for 7 days(200×)

3 討 論

3.1 M EL和 CYA對蛋雞肝臟功能的影響

血清 AST、ALT活性可反映肝臟功能。本試驗結果表明,單獨添加 MEL對血清 AST、ALT活性無顯著影響,與高春起等[6]的研究結果一致。但 Neerman等[7]給小鼠注射 40 mg/kg BW MEL 48 h后,血清 AST活性升高。其原因可能與本試驗 MEL給予方式與其不同或添加劑量低有關。有研究發(fā)現(xiàn),單獨灌胃 MEL對小鼠肝臟組織結構沒有明顯損傷[8]。本試驗中 35 d肝臟切片結果顯示 MEL只造成輕度脂肪變性和空泡變性等輕微損傷,可能是由于肝臟并非 MEL的靶器官,因此低劑量的 MEL更不會對肝臟造成嚴重損害。

謝志輝等[8]研究表明,給小鼠同時灌胃等量的 MEL、CYA(250、50、10 mg/kg BW)顯著提高了血清 AST和 ALT活性。本試驗中 MEL和CYA合用對血清 AST和 ALT活性無顯著影響,但從 35 d的肝臟組織切片結果可知,MEL和 CYA合用對肝臟損傷程度大于分別單獨添加的效應。

3.2 M EL和 CYA對蛋雞腎臟功能的影響

血清 CRE和 UA水平可反映腎臟功能。據(jù)林祥梅等[9]、李倜等[10]報道,貓和肉雞采食含有M EL的飼糧后,血清尿素氮(SUN)和 CRE含量超過正常水平。而 Puschner等[3]研究表明,單獨給予貓0.5%、1%的 MEL或 0.2%、0.5%、1%的CYA持續(xù) 10 d,對 SUN、CRE無顯著影響(P＞0.05)。本試驗中單獨添加 MEL對血清 UA、CRE沒有顯著影響(P＞0.05),可能因動物種屬差異等不同所致。

腎臟 T-AOC、SOD活性可反映腎臟清除自由基的能力,而 MDA含量可反應腎臟細胞受損的嚴重程度。本試驗中單獨添加 MEL對 21、35 d腎臟T-AOC、SOD活性和 MDA含量無顯著影響(P＞0.05),這與高春起等[11]的報道不一致,說明 MEL并未對蛋雞腎臟產(chǎn)生明顯氧化損傷。陳茜等[12]同時給小鼠灌胃 MEL和 CYA 250、50和 10mg/kg BW后,發(fā)現(xiàn)血清 CRE和腎臟 MDA含量升高,SOD活性降低,且呈劑量相關性。本試驗發(fā)現(xiàn),MEL與 CYA合用對血清 CRE和腎臟 MDA含量、SOD活性無顯著影響(P＞0.05),但提高了21 d血清 UA含量;35 d腎臟組織切片說明 M EL和 CYA會造成腎臟損傷。另有研究發(fā)現(xiàn),貓在飼喂含 2.4%MEL的飼糧 30 d后,腎小管管腔中出現(xiàn)晶體[9]。給狗灌服含有 30 mg/kg BW MEL和10mg/kg BW CYA的藥物膠囊后,腎臟中有結晶形成,出現(xiàn)間質(zhì)性腎炎和脂肪細胞變性等病理變化[13]。本試驗研究表明,MEL與 CYA合用對腎臟的毒害加劇,但未發(fā)現(xiàn)晶體。這可能是由動物種屬差異、染毒方式不同,或 MEL和 CYA的添加劑量低于蛋雞腎臟晶體形成的閾值[14]所致。另外,生理生化指標的變化和積累導致組織器官的病變,使機體產(chǎn)生病理癥狀[13]。本試驗中,腎臟T-AOC、SOD活性和 MDA含量以及血清 CRE含量無明顯異常,卻觀察到腎臟組織病變,這可能是腎臟代償作用的結果。腎臟是機體內(nèi)代謝最旺盛的器官之一,在組織發(fā)生病變的同時,腎臟可能正在或者已將不正常的指標代謝至正常范圍內(nèi)[15]。

3.3 蛋雞換喂基礎飼糧后對 MEL和 CYA毒性效應的消除作用

MEL和 CYA在單胃動物體內(nèi)進行惰性代謝,大部以原體或同系物形式排出,二者在動物體內(nèi)的半衰期分別為4.04[16]和2.5 h[17]。本試驗研究發(fā)現(xiàn),換喂基礎飼糧 7 d后,二者對蛋雞血清 UA及肝腎組織結構的不利影響均可消除,并恢復到對照組水平,證實停止飼喂含 MEL和 CYA飼糧后,蛋雞可將體內(nèi)的 MEL、CYA排出體外,緩解或消除對機體的損傷。

4 結 論

①蛋雞飼糧添加 M EL和 CYA顯著影響 21 d血清 UA含量,同時添加 MEL和 CYA組血清 UA含量高于單獨添加 MEL組;肝臟和腎臟組織結構發(fā)生不同程度病變,且合用的毒性大于單獨添加的毒性。

②停止飼喂含 MEL和 CYA飼糧 7 d后,可以消除 MEL和 CYA的不利影響。

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