陳元坤，歐紅萍，劉宗秀，李猶平

（1.四川省新獸藥工程技術(shù)研究中心，四川 成都 611130；2.成都農(nóng)業(yè)科技職業(yè)學院，四川 成都 611130）

1 流行病學

2011年3月，遂寧某豬場從外地引進100多頭仔豬2周后，引進豬和豬場原有母豬、仔豬同時發(fā)病，母豬發(fā)病率30%，死亡率10%左右，仔豬發(fā)病率90%，死亡率85%以上。豬場豬瘟的免疫已按正規(guī)免疫程序進行，母豬在1年前免疫過經(jīng)典藍耳疫苗，3個月前曾采取血液進行ELISA抗體測定，發(fā)現(xiàn)經(jīng)典藍耳血清抗體水平異常偏高，未對高致病性藍耳病進行免疫。

2 臨診癥狀

母豬體溫升高，在39.6～40.5℃，流產(chǎn)、產(chǎn)死胎，有的死亡；仔豬體溫升高至40.2～41℃，呼吸急促，耳根、臀、尾、腹部皮膚呈紫紅色，發(fā)病后大量死亡。

3 剖解病變

死亡豬只剖解的主要病變在肺臟，肺嚴重出血、壞死、肉變、間質(zhì)增寬、呈暗紅色；肺門淋巴結(jié)、腸系膜淋巴結(jié)及腹股溝淋巴結(jié)腫大、出血；胃黏膜充血，有的潰瘍；腎臟出血并有明顯壞死灶；脾臟有少量出血。

4 實驗室PCR病原檢測

4.1 試驗材料 豬經(jīng)典藍耳病毒、高致病性藍耳病毒與圓環(huán)病毒陽性對照。豬經(jīng)典藍耳病毒陽性對照采用豬藍耳病弱毒活疫苗CH-1R株，高致病性藍耳病采用弱毒活疫苗TJM-F92株，均由遂寧市船山區(qū)畜牧局提供；圓環(huán)病毒陽性對照為北京世紀元亨動物防疫技術(shù)有限公司生產(chǎn)。

待檢測病料：為送檢的剖解病變典型的肺臟、淋巴結(jié)、腎、脾臟等冷凍2d的病料，送檢病料為2頭份。

引物：豬經(jīng)典藍耳病病毒基因序列參照李勇等設計合成的位于美洲型毒株ORF7，即N蛋白基因區(qū)內(nèi)，上游引物PRRS-F：5′-TAAATATGCCAAAAACAAC-3′，下游引物PRRS-R：5′-TAGGTGACTTAGAGGCACA-3′，擴增片段長度為468bp。高致病性藍耳病毒基因引物參照范仲鑫等公開發(fā)表的引物序列，上游引物HPRRS-F：CGTAGAACTGTGACAACAAC，跨缺失區(qū)，對應于變異株序列的2917-2936，下游引物HPRRSR：TGAGTATTTTGGGCGTGTGAT，對應于變異株序列的3142-3162，目標產(chǎn)物長度為246bp。豬圓環(huán)病毒Ⅱ型基因引物參照許秀梅等設計合成的序列，上游引物PCVⅡ-F：5′-TAGGTTAGGGC（A/T）（G/T）TGGCCTT-3′，下游引物PCVⅡ-R：5′-CCGCACCTTCGGATATAGTGT-3′，擴增產(chǎn)物長度為263bp。

分子生物學試劑：病毒RNA提取試劑盒，病毒DNA提取試劑盒，2×Taq PCR Mixture反應試劑，標準DNA Marker2000、標準DNA MarkerⅡ等均購自北京天根生物科技有限公司；cDNA第一鏈合成試劑盒為TOYOTA(日本東洋紡)產(chǎn)品。

4.2 試驗方法 取病料適量，剪碎后加適量生理鹽水研磨，8000r/min離心1min，取上清用于病毒RNA和DNA的提取，提取方法按試劑盒說明進行。豬藍耳病、高致病性藍耳病RNA反轉(zhuǎn)錄體系和反轉(zhuǎn)錄程序為：病毒RNA 5μL，特異性下游引物1μL，dNTP mixture 2μL，RNase Inhibitor 1μL，Rever TraACE 1μL，5×RT Buffer 4μL，RNase free H2O 6μL，總共20μL；42℃，45min，99℃，5 min。反轉(zhuǎn)錄后按以下體系和程序進行PCR擴增：ddH2O 7.5μL，cDNA/DNA 3μL，上、下游引物各1 μL，2×Taq PCR Mixture 12.5 μL；94℃預變性3 min后，95℃ 30 s，藍耳病56℃、高致病性藍耳病52℃、圓環(huán)病毒Ⅱ62℃ 30 s，72℃ 1 min，共35個循環(huán)，最后72℃延伸10min。1%瓊脂糖凝膠電泳，當陽性對照和被檢樣品均擴增出與預期大小一致的條帶時判定為陽性結(jié)果，反之為陰性。

4.3 試驗結(jié)果 豬經(jīng)典藍耳、高致病性藍耳與圓環(huán)病毒Ⅱ型提取病毒基因組在進行PCR擴增后，陽性對照和被檢樣品均擴增出了與預期大小一致的條帶，豬經(jīng)典藍耳陽性對照及被檢樣品為468bp、高致病性藍耳陽性對照及被檢樣品為246bp，圓環(huán)病毒Ⅱ型陽性對照及被檢樣品為263bp左右，見圖1～圖3。結(jié)果表明被檢樣品中豬經(jīng)典藍耳、高致病性藍耳與圓環(huán)病毒Ⅱ型為陽性，陽性率100%。

圖1 經(jīng)典藍耳病毒PCR檢測結(jié)果

圖2 高致病性藍耳病毒PCR檢測結(jié)果

圖3 圓環(huán)病毒Ⅱ型PCR檢測結(jié)果

5 討論

藍耳病主要引起母豬繁殖障礙和仔豬呼吸道癥狀，臨診特征與豬瘟及許多呼吸道疾病相似，單獨依靠流行病學資料、癥狀及剖檢病變還不能確診，需要進一步的實驗室診斷。我們根據(jù)豬群的發(fā)病死亡情況、免疫狀況、臨診癥狀及剖解病變特征懷疑為藍耳病感染，同時由于豬場普遍存在圓環(huán)病毒的感染，所以我們對送檢病料進行了經(jīng)典藍耳、高致病性藍耳和圓環(huán)病毒Ⅱ型的PCR檢測，結(jié)果3種傳染病的陽性檢測率為100%。

近年來，豬場傳染病混合感染是導致豬只死亡和造成經(jīng)濟損失的主要原因。兩年來我們對豬場送檢病料的病原檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，豬場中藍耳病與圓環(huán)病毒的混合感染較普遍，受檢樣品中陽性率在90%以上，說明豬藍耳病和圓環(huán)病毒病仍是豬群中混合感染的原發(fā)性病原。此次送檢病料的豬場雖然免疫過經(jīng)典藍耳病疫苗，但由于缺乏科學的免疫程序和免疫后的抗體跟蹤監(jiān)測，導致免疫失敗而感染野毒，再加上未對高致病性藍耳病進行免疫，最終同時暴發(fā)了經(jīng)典藍耳病與高致病性藍耳病，還混合感染了圓環(huán)病毒。因此，在做好豬場生物安全措施的同時，應根據(jù)當?shù)匾卟×餍蟹N類和流行特征、豬只日齡、母源抗體水平情況來制定科學的免疫程序，并根據(jù)病情監(jiān)測結(jié)果隨時調(diào)整免疫程序，采用可靠的免疫方法和抗體監(jiān)測方法來預防此類傳染病的發(fā)生。

[1]李 勇，梅書棋，鄭 新，等.用RT-PCR對湖北省部分豬場豬繁殖與呼吸綜合癥的檢測[J].華中農(nóng)業(yè)大學學報，2006，19（4）：363-365.

[2]范仲鑫，劉道新，何世成，等.湖南高致病性豬藍耳病隱性感染情況調(diào)查[C].第三屆豬病防控學術(shù)研討會會議論文集，153-156.

[3]許秀梅，周緒斌，張馨玉，等.中等規(guī)模豬場保育豬圓環(huán)病毒病的實驗室診斷與控制 [J].中國畜牧獸醫(yī)，2006，33（12）：72-73.