盧云 楊秩 華小川 常新 貴林 王晟 賴文莉

（1.大連醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院 正畸教研室，大連 116044；2.四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院 正畸科，成都 610041；3.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院 正頜正畸聯(lián)合治療中心，上海 200011；4.云南省第二人民醫(yī)院 口腔正畸科，昆明 650021）

大鼠實驗性牙移動中配基門控陽離子通道P2X3受體在牙髓中的表達(dá)變化

盧云1，2楊秩3華小川4常新1貴林1王晟2賴文莉2

（1.大連醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院 正畸教研室，大連 116044；2.四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院 正畸科，成都 610041；3.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院 正頜正畸聯(lián)合治療中心，上海 200011；4.云南省第二人民醫(yī)院 口腔正畸科，昆明 650021）

目的 探討大鼠實驗性牙移動過程中配基門控陽離子通道P2X3受體在牙髓中表達(dá)變化，初步了解P2X3受體在正畸牙移動過程中的可能作用。方法 將54只雄性SD大鼠（體重200～250 g）隨機(jī)分為空白組（5只）、對照組（14只）和實驗組（35只）。選擇左側(cè)上頜第一磨牙作為觀察對象，獲取不同時間點牙髓組織切片，進(jìn)行免疫組織化學(xué)研究。結(jié)果 正畸牙移動加力后，牙髓中P2X3受體免疫陽性表達(dá)增加，并呈現(xiàn)一定的時間規(guī)律：即受力后1/6 d逐漸增加，3 d達(dá)到高峰，7 d后下降至加力前水平。結(jié)論 正畸牙移動疼痛信息傳遞過程中P2X3受體呈現(xiàn)有規(guī)律變化，推測P2X3受體與牙移動傷害表達(dá)密切相關(guān)，但其作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

實驗性牙移動； 牙髓； 疼痛； P2X3受體

研究證實三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）是線粒體氧化磷酸化的產(chǎn)物，是組織中傷害性刺激（包括疼痛）傳導(dǎo)的重要神經(jīng)遞質(zhì)。ATP與其配基門控陽離子通道P2X3受體結(jié)合后傳遞疼痛信息。P2X3受體是嘌呤受體P2X大家族的一員，可特異地在與C類傳入纖維相連的神經(jīng)元上表達(dá)[1]。目前已有較多的動物實驗證明支持P2X3受體介導(dǎo)傷害感受的理論，其中通過對P2X3受體基因敲除的大鼠實驗已經(jīng)比較明確了P2X3受體在大鼠的外周疼痛傳入中的主要作用[2]。實驗性牙移動可引起牙髓內(nèi)神經(jīng)纖維密度及分布的改變[3]，目前國內(nèi)外尚未見實驗性牙移動后P2X3受體在牙髓表達(dá)變化的研究報道，本研究主要目的在于探索正畸牙移動加力后P2X3受體在牙髓中的表達(dá)變化規(guī)律，并與外周神經(jīng)三叉神經(jīng)節(jié)（trigeminal ganglion，TG）和中樞神經(jīng)三叉神經(jīng)脊束核尾側(cè)亞核淺層（trigeminal subnucleus caudalis，TSC）進(jìn)行比較，從而為研究P2X3受體在正畸疼痛機(jī)制中的作用奠定堅實的基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物和分組

選用8周齡雄性SD大鼠54只，體重200～250 g（由四川大學(xué)華西動物中心提供），隨機(jī)分組飼養(yǎng)在玻璃箱中，給予晝夜生物節(jié)律飼養(yǎng)。

分為空白組（5只）、對照組（14只）、實驗組（35只）。對照組和實驗組又各分為1/6、1/2、1、2、3、5、7 d共7組。

1.2 實驗?zāi)Ｐ偷慕⒑蜆?biāo)本的制備

空白組的大鼠直接處死。其他組大鼠從腹部注射10%水合氯醛注射液（3mL·kg-1）。實驗組大鼠在左側(cè)上頜安放加力裝置，將直徑為0.25mm的不銹鋼結(jié)扎絲穿過大鼠左側(cè)上頜第一磨牙與第二磨牙鄰間隙后，將鎳鈦拉簧置于左側(cè)上頜第一磨牙與同側(cè)切牙之間，力值0.39 N，使磨牙產(chǎn)生近中傾斜移動，于各時間點處死各組大鼠。對照組大鼠進(jìn)行與實驗組相同的實驗過程但不加力，處理后與實驗組相同時間點處死。迅速取出處死大鼠左上頜第一磨牙的牙齒及其牙周組織，固定，漂洗，放入0.5molEDTA中脫鈣1個月，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，沿大鼠第一磨牙遠(yuǎn)中腭根行縱向連續(xù)切片，5μm厚，備做蘇木精-伊紅染色、免疫組織化學(xué)染色之用。

1.3 SP免疫組織化學(xué)分析法

梯度脫水，用3%的過氧化氫溶液處理切片，0.01mol PBS沖洗，0.1%胰酶修復(fù)，0.01mol PBS沖洗，滴入親和純化的P2X3兔抗鼠多克隆抗體（1∶300）約50μL于組織上，置于37℃濕盒中孵育60min后于4℃冰箱過夜，0.01mol PBS沖洗；加入第二抗體生物素化羊抗兔IgG（1∶200）滴在組織上，37℃濕盒中孵育60min；0.01mol PBS沖洗，加入辣根酶標(biāo)記白素三抗，37℃濕盒中孵育60min；0.01mol PBS沖洗，DAB染色。

1.4 圖像分析

采用Olympus光學(xué)顯微鏡進(jìn)行組織學(xué)觀察和陽性表達(dá)統(tǒng)計。每只大鼠選1張切片，每張切片在左上頜第一磨牙牙髓選擇3個區(qū)域，在高倍鏡下（×400）進(jìn)行分析，用尼康E600研究顯微鏡SPOT COD CCD攝像頭進(jìn)行圖像采集，選用Image-Pro Plus計數(shù)P2X3受體免疫陽性的光密度值，以3次測量值的均值作為該動物在該時間段的實測值。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

圖像分析結(jié)果采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行分析牙髓中空白組、對照組及實驗組之間的方差分析和兩兩比較，兩兩比較采用LSD法，比較3個組P2X3受體表達(dá)是否有差異。

2 結(jié)果

2.1 正常大鼠牙髓的解剖結(jié)構(gòu)

牙髓組織是由細(xì)胞、纖維和基質(zhì)構(gòu)成的一種疏松結(jié)締組織，負(fù)擔(dān)牙齒的營養(yǎng)、代謝、感覺和修復(fù)等功能，是牙體組織中唯一的軟組織，正常大鼠牙髓的解剖結(jié)構(gòu)見圖1。

圖1 大鼠牙髓形態(tài)Fig 1 Morphous of rat pulp

2.2 牙髓中P2X3受體的表達(dá)變化

牙髓中P2X3受體表達(dá)的免疫組織化學(xué)染色顯示：P2X3受體陽性表達(dá)為棕褐色，空白組及對照組大鼠牙髓組織中P2X3受體表達(dá)弱陽性，主要位于成牙本質(zhì)細(xì)胞層神經(jīng)叢，伸向前期牙本質(zhì)和牙本質(zhì)，冠髓和根髓中均有表達(dá)（圖2）。正畸加力后P2X3受體表達(dá)顯著增強(qiáng)，具體變化如下。

空白組、對照組及實驗組3組方差分析，三者總體均有差別，采用LSD法進(jìn)行兩兩比較。空白組與對照組比較P2X3受體陽性表達(dá)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），而實驗組各時間點與空白組和對照組之間進(jìn)行比較P2X3受體陽性表達(dá)差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

對照組與實驗組牙髓中各時間點P2X3受體陽性表達(dá)平均光密度值見表1，2組相同時間點進(jìn)行t檢驗分析，顯示二者之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，表明實驗中對大鼠的處理（麻醉、穿引結(jié)扎絲等）對實驗結(jié)果并無影響（P＞0.05）。

不同組牙髓中P2X3受體陽性表達(dá)變化見圖3。在大鼠牙加力移動后的1/6 d至7 d，實驗組P2X3受體免疫陽性表達(dá)比對照組有明顯升高，呈現(xiàn)短時上調(diào)變化并有一定時間規(guī)律：即受力后1/6 d逐漸增加，3 d達(dá)到高峰，7 d后下降至加力前水平。

表1 不同組不同時間點牙髓中P2X3受體染色光密度值Tab 1 P2X3 receptor staining optical density value at different experimental time in different groups ±s

表1 不同組不同時間點牙髓中P2X3受體染色光密度值Tab 1 P2X3 receptor staining optical density value at different experimental time in different groups ±s

注：*P<0.05。

時間/d 空白組 對照組 實驗組0 63 994.00±4 820.861 1/6 85 955.50±4 434.267 115 214.75±16 382.637* 1/2 60 792.00±8 995.812 157 738.00±46 705.536* 1 74 791.50±7 592.615 182 315.75±13 041.310* 2 62 435.00±3 964.041 215 673.75±15 211.197* 3 73 194.00±8 677.614 262 182.00±66 521.402* 5 61 957.00±4 712.160 164 793.75±22 691.308* 7 60 963.00±11 853.938 127 969.50±16 675.129*

圖3 不同組牙髓中P2X3受體陽性表達(dá)時間變化Fig 3 P2X3 receptor-positive expression in dental pulp at different experimental time in different groups

3討論

P2X3受體是神經(jīng)遞質(zhì)或神經(jīng)調(diào)質(zhì)ATP調(diào)控的配基門控陽離子通道，可獨立或者聯(lián)合在傷害感受器感覺神經(jīng)節(jié)的中小直徑神經(jīng)元如背根神經(jīng)節(jié)（dorsal root ganglion，DRG）、TG及節(jié)狀神經(jīng)節(jié)（nodose ganglion，NG）中高表達(dá)，另外在交感神經(jīng)節(jié)中亦有少量表達(dá)[4]。P2X3受體的這種顯著的選擇性表達(dá)提示它可能在ATP激活的傷害性感受活動中起傳感器的作用[5]。P2X3受體不僅在初級傳入神經(jīng)元的胞體有功能性表達(dá)，而且這些受體能雙向轉(zhuǎn)運到中樞和外周神經(jīng)。

在正畸力作用下，牙周膜、牙槽骨和牙齦等會發(fā)生組織相應(yīng)變化，即使輕微的力量也將對神經(jīng)有激惹并造成一定的神經(jīng)損傷，從而導(dǎo)致患者出現(xiàn)疼痛不適等感覺異常。牙髓組織有豐富的神經(jīng)支配，其感覺神經(jīng)來源于三叉神經(jīng)。Jiang等[6]研究證實：大鼠磨牙在根髓和冠髓處均見P2X3受體免疫陽性纖維存在，其形成成牙本質(zhì)細(xì)胞下層神經(jīng)叢，且伸向前期牙本質(zhì)和牙本質(zhì)。在人的第三磨牙牙髓內(nèi)亦見P2X3受體的存在和分布，在Raschkow成牙本質(zhì)細(xì)胞叢下以及成牙本質(zhì)細(xì)胞區(qū)的大部分纖維P2X3呈免疫反應(yīng)陽性[7]，且人與大鼠P2X3受體亞基有93%的同源性。本研究與以往研究結(jié)果類似，P2X3受體免疫陽性纖維主要分布于成牙本質(zhì)細(xì)胞層，冠髓和根髓中均有表達(dá)。

組織受損時導(dǎo)致ATP釋放，與P2X3受體結(jié)合后引起P2X3受體陽性感覺神經(jīng)元的去極化，從而激活了傷害感受器。本實驗顯示實驗性牙移動過程中大鼠牙髓P2X3受體免疫陽性表達(dá)呈現(xiàn)上調(diào)趨勢，即實驗組受力后1/6 d逐漸增加，實驗后3 d時達(dá)到高峰，至7 d下降到加力前水平，提示牙移動時造成了一定的神經(jīng)激惹，矯治力使牙齒一側(cè)神經(jīng)受壓另一側(cè)受牽張，激惹導(dǎo)致ATP的釋放，激活傷害感受器，而P2X3受體這個特殊的離子通道貫穿于神經(jīng)元胞膜內(nèi)外，當(dāng)ATP在細(xì)胞外部與其結(jié)合時就開放，從而激活了牙髓部分未表達(dá)或表達(dá)較弱的細(xì)胞，P2X3受體陽性表達(dá)增加。

本實驗結(jié)果及以前的神經(jīng)損傷的報道均發(fā)現(xiàn)：P2X3受體的表達(dá)在1周或者2周后出現(xiàn)降低，這可能是局部組織已經(jīng)逐漸適應(yīng)外界刺激的緣故，也說明P2X3受體的表達(dá)變化可隨刺激而變化，是短時間的效應(yīng)，不是一個持續(xù)的變化，也符合了牙移動的一過性疼痛規(guī)律，提示P2X3受體在牙移動疼痛中的重要作用。在以往對人正畸牙移動疼痛的研究中發(fā)現(xiàn)[8]：放置弓絲后4 h疼痛開始增加，并且在1/2 d已達(dá)到峰值，3 d后開始回落，7 d后基本恢復(fù)正常。這與本實驗得出的P2X3受體陽性表達(dá)變化的規(guī)律相似。因此推測，本實驗動物模型在一定程度上模擬人正畸牙移動時傷害信息的傳遞過程，P2X3受體可能在其中有著重要作用。

在課題組以往的研究中發(fā)現(xiàn)實驗性正畸牙移動過程中，TG中P2X3受體表達(dá)為一過性變化，呈現(xiàn)短時上調(diào)的規(guī)律，時間與正畸牙移動時的疼痛時間吻合，TSC加力側(cè)的P2X3受體表達(dá)變化也呈現(xiàn)短時上調(diào)的規(guī)律，其與外周的表達(dá)規(guī)律基本相同，本研究發(fā)現(xiàn)：在受力局部牙髓中P2X3受體亦表現(xiàn)出類似的變化規(guī)律，因此推測P2X3受體在受力局部、外周和中樞都與牙移動傷害表達(dá)及傳遞密切相關(guān)，但其作用機(jī)制還有待進(jìn)一步探索[9]。

本研究肯定了P2X3受體在正畸牙移動疼痛中的重要作用，初步探索了P2X3受體在牙髓中的表達(dá)變化，但是僅對表達(dá)進(jìn)行了定性的分析，對于定量的統(tǒng)計及其表達(dá)的機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。在今后的研究中可以探索P2X3受體在其拮抗劑作用下表達(dá)變化的規(guī)律以及與其他疼痛介質(zhì)的相互作用[10-11]，進(jìn)而期待揭示P2X3受體在正畸疼痛中的扮演的角色，尋找切實有效的緩解正畸疼痛的方法。

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（本文編輯 湯亞玲）

Expression of ligand-gated cation channels P2X3receptor in rat pulp during experimental tooth movement

LU Yun1，2,YANG Zhi3,HUA Xiao-chuan4,CHANG Xin1,GUI Lin1,WANG Sheng2,LAIWen-li2.（1.Dept.of Orthodontics,College of Stomatology,Dalian Medical University,Dalian116044,China;2.Dept.of Orthodontics,West China College of Stomatology,Sichuan University,Chengdu610041,China;3.Joint Orthodontics-Orthognathic Surgery Center,The Ninth People’s Hospital,Shanghai Jiao Tong University School of Medicine,Shanghai200011,China; 4.Dept.of Orthodontics,The Second People’s Hospital of Yunnan Province,Kunming650021,China）

ObjectiveTo investigate ligand-gated cation channels P2X3receptors changes in rat pulp during experimental tooth movement（ETM）,and preliminarily find their possible effect during ETM.Methods54 male SD rats（200-250 g）were selected and randomly divided into blank group（5 rats）,control group（14 rats）and experimental group（35 rats）.The left maxillary first molar was selected as observation object,the pulp tissue biopsies was taken at different time points to carry out immunohistochemical study.Results Predominant up regulation of P2X3receptors immunoactivity was found in pulp from 1/6 d to 7 d after experimental tooth movement.It started to significantly increase at 1/6 d,peaked at 3 d,and then decreased continuously until 7 d as compared with the beginning.ConclusionP2X3receptors have a rhythm change in rat pulp as a result of ETM,speculated that P2X3receptors is closely related to the tooth movement injury,but the mechanism of action need further researches.

experimental tooth movement； pulp； pain； P2X3receptor

R 781.4

A

10.3969/j.issn.1000-1182.2011.02.021

1000－1182（2011）02－0183-04

2010-06-29；

2010-11-20

盧云（1982—），女，河北人，碩士

賴文莉，Tel:028-85501442