申濤 ?；劬?簡(jiǎn)從相 楊彥春 周繼祥

（1.第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院 口腔科，重慶 400038；2.四川省軍區(qū)門(mén)診部 口腔科，成都 610041）

改良法分離培養(yǎng)人牙周膜干細(xì)胞

申濤1?；劬?簡(jiǎn)從相1楊彥春1周繼祥1

（1.第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院 口腔科，重慶 400038；2.四川省軍區(qū)門(mén)診部 口腔科，成都 610041）

目的 改良法體外分離培養(yǎng)人牙周膜干細(xì)胞（PDLSC），并進(jìn)行鑒定。方法 采用酶消化組織塊法獲得人牙周膜細(xì)胞，通過(guò)有限稀釋法克隆化培養(yǎng)、分離得到PDLSC，用含10%FBS的α-MEM培養(yǎng)液培養(yǎng)并傳代；測(cè)定克隆形成率；免疫組織化學(xué)檢測(cè)角蛋白及波形蛋白表達(dá)；流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期及表面標(biāo)志物STRO-1、CD146的表達(dá)；并進(jìn)行成骨、成脂誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果 本研究所得細(xì)胞有較強(qiáng)的克隆形成能力，波形蛋白染色陽(yáng)性，角蛋白陰性，細(xì)胞周期分析大多細(xì)胞處于G0/G1期，STRO-1及CD146高表達(dá)，成骨、成脂誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)證明所得細(xì)胞有多向分化能力。結(jié)論 改良法克隆化培養(yǎng)可成功分離得到PDLSC，為進(jìn)一步研究PDLSC奠定了基礎(chǔ)。

人牙周膜干細(xì)胞； 鑒定； 細(xì)胞克隆

隨著干細(xì)胞研究的不斷深入，越來(lái)越多的組織中發(fā)現(xiàn)有干細(xì)胞存在。近年證實(shí)，人牙周膜組織中也存在干細(xì)胞[1]，即牙周膜干細(xì)胞（periodontal ligament stem cells，PDLSC）。研究[1-3]發(fā)現(xiàn)：PDLSC具有較強(qiáng)的克隆形成能力，體外誘導(dǎo)可分化為成骨細(xì)胞、成脂細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞及神經(jīng)元樣細(xì)胞，在體內(nèi)可形成牙骨質(zhì)/牙周膜樣結(jié)構(gòu)。牙周膜組織中的干細(xì)胞數(shù)量較少，且缺乏特定的標(biāo)志物，文獻(xiàn)亦未見(jiàn)特殊有效的分離方法報(bào)道。本研究在既往PDLSC分離純化方法的基礎(chǔ)上，進(jìn)行了探索和改良，利用有限稀釋法克隆化培養(yǎng)，對(duì)人PDLSC進(jìn)行分離純化，并證實(shí)所得細(xì)胞具有干細(xì)胞特性，為PDLSC的進(jìn)一步研究和應(yīng)用打下基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

α-MEM培養(yǎng)液（Hyclone公司，美國(guó)），胎牛血清（Hyclone公司，美國(guó)），Ⅰ型膠原酶（Gibco公司，美國(guó)），0.25%胰蛋白酶（Hyclone公司，美國(guó)）；小鼠抗人AF647-STRO-1和PE-CD146流式抗體（Biolegend公司，美國(guó)），小鼠抗人Vimentin單抗（BD公司，美國(guó)），小鼠抗人pan-Cytokeratin單抗（Santa公司，美國(guó)），Envision免疫組織化學(xué)試劑盒（Dako公司，丹麥），BSA（Sigma公司，美國(guó)）；成骨及成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)液（Cyagen公司，美國(guó)）。

1.2 人牙周膜干細(xì)胞的分離培養(yǎng)

1.2.1 人牙周膜細(xì)胞原代培養(yǎng) 取12～24歲之間因正畸或阻生而拔除的牙體牙周均健康的新鮮牙齒，用含雙抗PBS反復(fù)沖洗，冠根單向刮取根中三分之一的牙周膜，修剪組織塊為1mm3大小，1mg·mL-1Ⅰ型膠原酶37℃消化40min后，將組織塊均勻平鋪于6孔板內(nèi)，上蓋無(wú)菌玻片，加入少量α-MEM培養(yǎng)液（含10%FBS、100 U·mL-1青霉素和100μg·mL-1鏈霉素），放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱，每3 d換液，細(xì)胞長(zhǎng)至孔底60%左右時(shí)，胰酶消化。

1.2.2 有限稀釋法克隆化培養(yǎng)分離人牙周膜干細(xì)胞將消化的牙周膜細(xì)胞懸液計(jì)數(shù)，并調(diào)整細(xì)胞密度為每毫升30、10和5個(gè)，將3種密度的細(xì)胞懸液吹打均勻，種于96孔板，每孔100μL，放入37℃、5% CO2培養(yǎng)箱，8～12 h后鏡下觀察標(biāo)記單個(gè)細(xì)胞孔，并補(bǔ)液200μL，5 d換液，待標(biāo)記孔克隆長(zhǎng)至孔底40%左右時(shí)，胰酶消化，擴(kuò)大培養(yǎng)。

1.3 人牙周膜干細(xì)胞的鑒定

1.3.1 克隆形成實(shí)驗(yàn) 將消化的牙周膜細(xì)胞懸液計(jì)數(shù)，分別取200、500、800個(gè)細(xì)胞接種于3個(gè)直徑10 cm培養(yǎng)皿中，各加入20mLα-MEM培養(yǎng)液（含10%FBS、100 U·mL-1青霉素和100 U·mL-1鏈霉素），十字搖勻，放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱，靜置培養(yǎng)。3周后終止培養(yǎng)，純甲醇固定15min，姬姆薩工作液染色20min，計(jì)數(shù)并測(cè)定克隆形成率。

1.3.2 免疫組織化學(xué)染色 取第4代PDLSC制備細(xì)胞爬片，PBS漂洗，預(yù)冷4%多聚甲醛固定20min，免疫組織化學(xué)Envision法角蛋白、波形蛋白染色，進(jìn)行細(xì)胞來(lái)源鑒定，空白對(duì)照用PBS代替一抗，光鏡觀察。

1.3.3 流式細(xì)胞術(shù)分析 收集第4代PDLSC，加入無(wú)血清α-MEM培養(yǎng)基，制備單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為每毫升3×107個(gè)，分別加入4支EP管，每管100μL，分別加入小鼠抗人STRO-1、CD146及同型對(duì)照單抗，4℃避光孵育45min，PBS漂洗，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

收集第4代PDLSC約3×106個(gè)，制備單細(xì)胞懸液，離心后加入預(yù)冷的70%乙醇1.5mL吹打混勻，4℃過(guò)夜，離心棄乙醇，PBS洗，加入50μg·mL-1的碘化丙錠1mL，4℃染色30min，過(guò)200目尼龍篩網(wǎng)，流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞周期分析。

1.3.4 多向誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn) 取第4代PDLSC，制備單細(xì)胞懸液并計(jì)數(shù)，成骨誘導(dǎo)按每孔1×104個(gè)細(xì)胞、成脂誘導(dǎo)按每孔5×104個(gè)細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板內(nèi)，孔底預(yù)置無(wú)菌玻片，待48～72 h細(xì)胞貼壁長(zhǎng)滿后分別更換成骨、成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)液，按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行培養(yǎng)誘導(dǎo)。3周后吸去誘導(dǎo)液，10%中性甲醛固定，茜素紅、油紅O染色，光鏡觀察。

2 結(jié)果

2.1 人牙周膜干細(xì)胞的形態(tài)特征

原代培養(yǎng)4～12 d組織塊周圍開(kāi)始有牙周膜細(xì)胞爬出，為長(zhǎng)梭形或不規(guī)則形，約2～3周細(xì)胞長(zhǎng)滿孔底60%。96孔培養(yǎng)板克隆化培養(yǎng)10 d左右可出現(xiàn)細(xì)胞克隆，2～4周克隆可長(zhǎng)至孔底40%以上，所得細(xì)胞即為PDLSC，形態(tài)與牙周膜細(xì)胞相似，為梭形、多角形或不規(guī)則形，體積稍小，呈漩渦狀或放射狀排列（圖1）。

圖1 PDLSC的形態(tài)特征Fig 1 Morphology of PDLSC

2.2 人牙周膜干細(xì)胞的鑒定

2.2.1 克隆形成率 3周后，鏡下可見(jiàn)克隆形成，細(xì)胞體積小，排列緊密，克隆中心細(xì)胞密度最大，界限不清，為圓形、橢圓形或不規(guī)則狀，邊緣細(xì)胞為長(zhǎng)梭形。染色后可見(jiàn)克隆為藍(lán)色，計(jì)數(shù)并測(cè)得克隆形成率為13.87%，說(shuō)明該細(xì)胞在體外具有較強(qiáng)的克隆形成能力（圖2左）。

2.2.2 免疫組織化學(xué)染色 分離培養(yǎng)的PDLSC其波形蛋白染色陽(yáng)性，角蛋白陰性，說(shuō)明所得細(xì)胞為間充質(zhì)來(lái)源，無(wú)上皮細(xì)胞污染（圖2中、右）。

2.2.3 流式細(xì)胞術(shù)分析 流式細(xì)胞術(shù)表型分析單標(biāo)STRO-1陽(yáng)性率為89.94%，單標(biāo)CD146陽(yáng)性率為90.47%，STRO-1和CD146雙標(biāo)陽(yáng)性率為82.10%，說(shuō)明所得PDLSC表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞早期標(biāo)志物；細(xì)胞周期分析顯示G0/G1期細(xì)胞為80.04%，G2期細(xì)胞為9.53%，S期細(xì)胞為10.43%，表明PDLSC具有慢周期性的特點(diǎn)（圖3）。

2.2.4 多向誘導(dǎo)分化 成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)10 d后細(xì)胞逐漸變成方形或多角形，3周后可見(jiàn)礦化結(jié)節(jié)，茜素紅染色陽(yáng)性（圖4左）；成脂誘導(dǎo)3周后，鏡下可見(jiàn)脂滴形成，油紅O染色陽(yáng)性（圖4右）。

圖4 PDLSC誘導(dǎo)3周后染色Fig 4 Staining of PDLSC after 3-week osteogenic and adipogenic induction

3 討論

牙周膜細(xì)胞為間充質(zhì)來(lái)源，且具有異質(zhì)性[4]，其中某些細(xì)胞具有成體干細(xì)胞的特點(diǎn)，在牙周組織的修復(fù)再生和功能穩(wěn)定中發(fā)揮著重要作用。近來(lái)有學(xué)者利用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSC）早期標(biāo)志物STRO-1從牙周組織中成功分離了具有干細(xì)胞特征的細(xì)胞群，并命名為PDLSC[1-2]。研究[1-2，5-6]發(fā)現(xiàn)：PDLSC除了表達(dá)STRO-1以外，還表達(dá)CD146、SH2、SH3、SH4、CD105、CD44、CD29、VCAM-1、ALP、α-平滑肌動(dòng)蛋白等一系列的細(xì)胞表面標(biāo)志物。但由于目前尚未發(fā)現(xiàn)PDLSC的特異性標(biāo)志物，那么這僅表明用抗STRO-1分離所得細(xì)胞群富含干細(xì)胞，里面可能還包括一些其他前體細(xì)胞[7]，如果要得到高度純化的PDLSC，必須聯(lián)合使用多種抗體[8]，或者選用其他分離方法，如有限稀釋法。有限稀釋法是采用梯度倍數(shù)稀釋的原則，將細(xì)胞懸液連續(xù)倍數(shù)稀釋至極低密度，然后接種于微孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)一定時(shí)間后，微孔中可出現(xiàn)單個(gè)細(xì)胞克隆[9]，擴(kuò)大培養(yǎng)后可以得到性質(zhì)均一的細(xì)胞群。故理論上有限稀釋法克隆化培養(yǎng)所得PDLSC的生物學(xué)特性更均一，更利于對(duì)該細(xì)胞群的進(jìn)一步研究。

本研究采用酶消化組織塊法原代培養(yǎng)人牙周膜細(xì)胞，與其他方法相比，不僅操作簡(jiǎn)單，需要組織量少，而且有較高的成功率[10-11]；使用較低濃度Ⅰ型膠原酶短時(shí)間消化，既松散了組織，利于細(xì)胞游出，也降低了酶對(duì)細(xì)胞的不良影響；使用玻片覆蓋，提高了組織塊的貼壁率，進(jìn)而利于獲得人牙周膜細(xì)胞。有限稀釋法克隆化培養(yǎng)時(shí)，為了減少細(xì)胞計(jì)數(shù)及倍數(shù)稀釋過(guò)程中的誤差，設(shè)置了3種細(xì)胞接種密度，提高了單個(gè)細(xì)胞孔的出現(xiàn)機(jī)率；在接種12 h內(nèi)完成鏡下單個(gè)細(xì)胞孔的標(biāo)記，避免了活性較好的細(xì)胞分裂，從而得到嚴(yán)格意義上的細(xì)胞克隆。本研究所得細(xì)胞免疫組織化學(xué)染色波形蛋白陽(yáng)性，角蛋白陰性，說(shuō)明所得細(xì)胞為間充質(zhì)來(lái)源，且無(wú)上皮細(xì)胞的污染；STRO-1和CD146是鑒定PDLSC常用的2個(gè)標(biāo)志物[1，6]，流式細(xì)胞術(shù)分析發(fā)現(xiàn)二者陽(yáng)性率均在90%左右，雙標(biāo)陽(yáng)性率亦大于80%，表明其具有PDLSC的表型特征。

克隆形成能力和慢周期性是干細(xì)胞的重要特征。MSC和牙周膜細(xì)胞在極低密度培養(yǎng)條件下，可表現(xiàn)出很強(qiáng)的自我復(fù)制能力并形成克隆[1]，這表明MSC和牙周膜細(xì)胞或者說(shuō)其中的某群細(xì)胞具有很強(qiáng)的增殖能力，具有從一個(gè)單細(xì)胞形成克隆的潛能。Digirolamo等[12]研究得出，培養(yǎng)細(xì)胞在低密度條件下生長(zhǎng)時(shí)，其自我復(fù)制的潛能可以通過(guò)克隆形成率很好地反映出來(lái)，克隆形成率越高，其增殖能力越強(qiáng)。本研究測(cè)得牙周膜細(xì)胞具有較高的克隆形成率，提示其中的某群細(xì)胞具有干細(xì)胞特征。但此結(jié)果與Seo等[1]、高秦等[13]有較大差異，與潘峰等[14]結(jié)果相近，這可能與細(xì)胞個(gè)體來(lái)源、分離培養(yǎng)方式、測(cè)定方法等差異有關(guān)。通常狀況下，干細(xì)胞處于一種慢周期狀態(tài)，當(dāng)組織損傷修復(fù)時(shí)，它們的增殖速度可迅速提高。本研究發(fā)現(xiàn)PDLSC絕大部分處于G0/G1期，說(shuō)明其具有慢周期性的特點(diǎn)。

PDLSC具有多向分化的能力，它不僅可以分化為來(lái)源組織的細(xì)胞，而且還可以橫向分化為其他譜系的細(xì)胞[1-3]。PDLSC存在于體內(nèi)牙周膜組織的微環(huán)境中，在周圍組織細(xì)胞分泌的各種因子作用下，保持其干細(xì)胞特性不變；而在體外如何保持其未分化狀態(tài)是分離培養(yǎng)成功的關(guān)鍵，也是目前體外研究的一個(gè)難點(diǎn)。高秦等[13]在克隆化培養(yǎng)過(guò)程中收集牙周膜細(xì)胞的培養(yǎng)上清，與基礎(chǔ)培養(yǎng)基混合作為適應(yīng)性培養(yǎng)液，以利保持PDLSC未分化狀態(tài)。但由于目前干細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)機(jī)制尚不清楚，本研究發(fā)現(xiàn)：不采用適應(yīng)性培養(yǎng)液，亦可得到PDLSC，從而便于操作，減少了污染機(jī)率，并且在特定培養(yǎng)條件下，亦可成功將其誘導(dǎo)為成骨細(xì)胞和成脂細(xì)胞，證明所得PDLSC具有多向分化的能力。但是，隨著體外擴(kuò)增和連續(xù)傳代，PDLSC這個(gè)細(xì)胞群可能會(huì)變得不均一[15]，逐漸丟失一些干性，甚至老化，所以如何在體外完全保持干細(xì)胞特性還需要進(jìn)一步研究。

綜上所述，改良法克隆化培養(yǎng)可以得到純化的PDLSC，為進(jìn)一研究PDLSC奠定了基礎(chǔ)，也為牙周組織工程獲得理想的種子細(xì)胞提供了可靠的方法。

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（本文編輯 湯亞玲）

Isolation and identification of human periodontal ligament stemcells in vitro

SHEN Tao1,CHANG Hui-jun2,JIAN Cong-xiang1,YANG Yan-chun1,ZHOU Ji-xiang1.（1.Dept.of Stomatology,Southwest Hospital,The Third Military Medical University,Chongqing400038,China；2.Dept.of Stomatology,Out-patient Department of Sichuan Military Area Command,Chengdu610041,China）

ObjectiveTo isolate and identify human periodontal ligament stem cells（PDLSC）by improved methods and assess the characteristics of PDLSCex vivo.MethodsThe periodontal ligament cells were obtained from the healthy impacted third molars and teeth extracted for orthodontic purposes and used to isolate PDLSC by limiting dilution assay.PDLSC were cultured and expanded inα-MEM supplemented with 10%FBS.Colony-forming assay, immunohistochemistry,flow cytometry,osteogenic and adipogenic induction were used to identify PDLSC.Results The obtained cells had high colony-forming efficiency and were positive staining for vimentin and negative for pancytokeratin.Flow cytometry revealed that the isolated cells were positive for STRO-1 and CD146 antibodies and most were in the G0/G1phase of cell cycle.Under specific conditions,they could differentiate to the osteoblast and adipocyte lineagesin vitro.ConclusionLimiting dilution assay is an effective method to isolate PDLSC and the single-cell-derived colonies demonstrate the properties of stem cellsin vitro.

human periodontal ligament stem cells； identification； cell clone

R 781.4

A

10.3969/j.issn.1000-1182.2011.01.017

1000－1182（2011）01－0071-04

2010-05-22；

2010-07-20

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（30870599）

申濤（1982—），男，河北人，碩士

周繼祥，Tel：023-68754387