王相晶，王曉舟，張 繼，朱兆香，向文勝*，張勻華

（1.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士后工作站，哈爾濱 150001；2.東北林業(yè)大學(xué)博士后流動(dòng)站，哈爾濱 150086；3.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030）

放線菌可產(chǎn)生具有結(jié)構(gòu)多樣性的代謝產(chǎn)物，在工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和人類疾病防治中發(fā)揮重要的作用[1-3]。隨著大量新抗生素篩選工作的開展，具有生物活性的菌株及其代謝產(chǎn)物被大量發(fā)現(xiàn)，利用傳統(tǒng)分離放線菌的方法往往導(dǎo)致菌株的重復(fù)分離以及新化合物的發(fā)現(xiàn)幾率降低等一系列問題[4]。而對(duì)微生物的基因組序列分析顯示微生物的基因組中含有大量潛在的次級(jí)代謝合成基因簇，其數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過已知的抗生素的種類[5]。僅在Streptomyces coelicolor、S.avermitilis和S.griseus的基因組中就分別發(fā)現(xiàn)20、25和34個(gè)參與次級(jí)代謝的基因簇，這些基因簇大都處于沉默狀態(tài)，只有在特定的條件下才能表達(dá)[6-8]。目前通過激活放線菌的潛在的次級(jí)代謝合成途徑而對(duì)已知的放線菌資源進(jìn)行開發(fā)的新技術(shù)的研究正成為微生物天然產(chǎn)物的熱點(diǎn)之一，而抗生素抗性篩選的方法由于具有操作簡單，成本較低而備受關(guān)注[9-10]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，土壤微生物經(jīng)鏈霉素（Streptomycin）、慶大霉素（Gentamycin）和利福平（Rifampicin）篩選后能存活的菌株中，有50%的可產(chǎn)生抗生素，這一比例遠(yuǎn)高于普通微生物的篩選比率[11]。此外，該方法還被用于賦予放線菌抗生素抗性突變，以用于提高放線菌次級(jí)代謝物的產(chǎn)量[12-13]。

為了獲得更多具有生物活性的化合物及其產(chǎn)生菌株，本研究利用多重抗生素抗性篩選的方法對(duì)不同地區(qū)土樣中分離得到的放線菌進(jìn)行鏈霉素、慶大霉素和利福平的三重抗性篩選，最終獲得對(duì)三種抗生素均有較高抗性并具有抑菌活性的菌株，并對(duì)該菌株進(jìn)行了分子生物學(xué)的鑒定以及發(fā)酵產(chǎn)物的初步研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土壤樣品

挑選了內(nèi)蒙古呼倫貝爾市、福建省仙游縣、江西省豐城市以及浙江省富陽市內(nèi)的4個(gè)樣區(qū)，采集15～20 cm深的土樣，3～5點(diǎn)混合為一份，放入無菌紙袋中（見表1），-20℃長期保存。使用前將土樣鋪于無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，25～28℃自然干燥7～14 d后磨碎備用。

表1 采集土樣的基本信息Table1 The essential information of soil samples

1.1.2 生物活性測定菌

枯草芽孢桿菌ATCC 6633（Bacillus subtilis）及藤黃微球菌 ATCC 9341（Micrococcus luteus）為本實(shí)驗(yàn)室保存菌。

1.1.3 培養(yǎng)基

①分離及抗性篩選培養(yǎng)基:高氏一號(hào)培養(yǎng)基[14]。

②種子培養(yǎng)基:黃豆餅粉1.0%，棉籽餅粉1.0%，玉米淀粉2.0%，葡萄糖0.5%，pH 7.2。

③發(fā)酵培養(yǎng)基:蔗糖4%，可溶性淀粉4%，CaCO30.3%，KNO30.1%，NaCl 0.05%，K2HPO4·3H2O 0.05%，MgSO4·7H2O 0.05%，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.001%，pH 7.4～7.6。

④生物活性測定培養(yǎng)基:枯草芽孢桿菌ATCC 6633的培養(yǎng)基配方為:多聚蛋白胨1%，牛肉膏 0.15%，NaCl 0.5%，瓊脂 1.3%，pH 7.8～8.0。藤黃微球菌ATCC 9341的培養(yǎng)基配方為:多聚蛋白胨0.6%，牛肉膏0.15%，酵母膏0.3%，水解酪蛋白0.4%，葡萄糖0.1%，瓊脂1.3%，pH 7.8～8.0。

1.2 方法

1.2.1 放線菌分離

取上述5 g土樣置于含15～20個(gè)小玻璃珠已滅菌的三角瓶中，加入45mL無菌水，即為土壤浸液。將土壤浸液于30℃搖振20 min，過濾后適當(dāng)稀釋分別涂布高氏一號(hào)培養(yǎng)基，其中加入終濃度為2μg·mL-1的青霉素和75μg·mL-1的重鉻酸鉀[15]。

1.2.2 原始放線菌抑菌活性測定

將分離得到的待測菌株接入發(fā)酵培養(yǎng)基，30 ℃，250 r·min-1培養(yǎng)6～8 d，直至發(fā)酵液顏色逐漸加深，菌絲體碎片逐漸增多，停止發(fā)酵。以枯草芽孢桿菌和藤黃微球菌為指示菌，用單層杯碟法測定發(fā)酵液的抑菌活性，每孔加發(fā)酵液100μL，37℃培養(yǎng)24 h，用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑[16]。

1.2.3 放線菌單孢子懸浮液的制備

待斜面培養(yǎng)基上的孢子成熟后，加入無菌水，用接種環(huán)刮下孢子并制成單孢子懸浮液，無菌濾紙過濾后調(diào)整孢子濃度為106cfu·mL-1[17]。

1.2.4 放線菌的三重抗性篩選

取200μL放線菌單孢子懸浮液分別涂布于含有2、5、10、20、40μg·mL-1鏈霉素的高氏一號(hào)平板培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)7～14 d后，挑取可在較高抗生素濃度下生長的菌株并用同樣方法涂布于含有1、3、5、8、10μg·mL-1慶大霉素的高氏一號(hào)平板，長出成熟的孢子后，挑取可在較高抗生素濃度下生長的菌株涂布于含有10、50、100、150、200μg·mL-1利福平的高氏一號(hào)平板繼續(xù)篩選，將最終獲得的具有三重抗性的放線菌進(jìn)行保存及擴(kuò)大培養(yǎng)，比較抑菌效果后選擇抗性及抑菌效果均較高的放線菌用于后續(xù)研究。并暫時(shí)將所獲得的一株目的菌命名為1號(hào)放線菌。

1.2.5 1號(hào)放線菌的發(fā)酵培養(yǎng)

取濃度為106cfu·mL-1的孢子懸液200μL加入裝有25mL種子培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，30℃，250 r·min-1震蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期后以8%接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃，250 r·min-1培養(yǎng)，每隔24 h做鏡檢觀察，測定發(fā)酵液pH和生物量，并取發(fā)酵液上清以及沉淀浸提液用于生物活性測定等試驗(yàn)。

1.2.6 抑菌物質(zhì)穩(wěn)定性試驗(yàn)

取發(fā)酵液上清以及沉淀浸提液，調(diào)整pH為2、 4、 7、 9、 11，在 室 溫 、 30、 40、 50、 60、70、80和90℃分別處理0.5、1及1.5 h，比較處理前后發(fā)酵液上清以及沉淀浸提液的抑菌活性。

1.2.7 1號(hào)放線菌的16S rDNA鑒定

基因組DNA提取及16S rDNA擴(kuò)增參考文獻(xiàn)[18-19]。PCR產(chǎn)物測序后將序列提交至NCBI數(shù)據(jù)庫，應(yīng)用Blast程序與數(shù)據(jù)庫中已有的細(xì)菌16S rDNA序列進(jìn)行相似性比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤放線菌分離結(jié)果

結(jié)果見圖版Ⅰ。

圖版I 20種放線菌菌落形態(tài)Plate I Colony morphology of twenty actinomycetes

從上述4個(gè)地區(qū)的土樣中共分離到20株天然無抗菌活性或抗菌活性微弱放線菌（抑菌圈＜2 mm）。圖版Ⅰ為所篩選到的20株放線菌的單菌落形態(tài)。其中1～5號(hào)菌由內(nèi)蒙古呼倫貝爾市伊敏鎮(zhèn)的土樣中篩選得到；6～9號(hào)菌由福建省仙游縣紫澤村的土樣中篩選得到；10～16號(hào)菌由江西省豐城市圳頭鄉(xiāng)的土樣中篩選得到；17～20號(hào)菌由浙江省富陽市胥口鎮(zhèn)的土樣中篩選得到。

2.2 放線菌的抗性篩選結(jié)果

放線菌的三重抗生素抗性篩選結(jié)果如表2所示。

在所分離得到的20株放線菌中，當(dāng)培養(yǎng)基中含有10μg·mL-1鏈霉素時(shí)，只有1號(hào)和2號(hào)放線菌有菌落長出，當(dāng)培養(yǎng)基中含有8μg·mL-1慶大霉素時(shí)，只有1、3和9號(hào)放線菌有菌落長出；當(dāng)培養(yǎng)基中含有150μg·mL-1利福平時(shí)，只有1、4、5和20號(hào)放線菌有菌落長出。其中只有1號(hào)放線菌能在含有40μg·mL-1鏈霉素、10μg·mL-1慶大霉素以及150μg·mL-1利福平的平板上生長。抑菌活性測定結(jié)果顯示，在20株放線菌中，有17株經(jīng)過抗性篩選后產(chǎn)生了抑菌活性，其中1號(hào)放線菌對(duì)枯草芽孢桿菌及藤黃微球菌的抑菌圈直徑分別為20.52和23.23 mm，均高于其他放線菌。故選用1號(hào)放線菌進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

表2 鏈霉素、慶大霉素及利福平抗性篩選放線菌結(jié)果Table2 Results of resistance screening to streptomycin,gentamicin and rifampicin

2.3 發(fā)酵時(shí)間與發(fā)酵液pH、菌絲體生物量以及菌液生物活性之間的關(guān)系

將1號(hào)放線菌進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，每隔24 h測定發(fā)酵液pH和菌體生物量。由圖2可以看出，隨著時(shí)間變化，發(fā)酵液pH經(jīng)過了先升高后降低再升高的過程，生物量呈現(xiàn)先升高后降低的變化，于第10天達(dá)到最大濃度。鏡下觀察顯示，第10天后，菌絲體開始斷裂。

圖2 1號(hào)放線菌發(fā)酵液pH和生物量隨發(fā)酵時(shí)間的變化Fig.2 Correlations between fermentation time and pH or packed mycelium volume

菌液生物活性與發(fā)酵時(shí)間之間的關(guān)系如圖3所示。由圖3可知1號(hào)放線菌發(fā)酵液的抑菌活性呈先升高后降低的趨勢(shì)，在第10天左右達(dá)到活性最大值。由此可以確定1號(hào)放線菌在該發(fā)酵條件下的最適發(fā)酵時(shí)間為10 d。

圖3 發(fā)酵液對(duì)枯草芽孢桿菌及藤黃微球菌抑制活性Fig.3 Correlations between fermentation time and inhibitory activity on Bacillus subtilis and Micrococcus luteus

2.4 發(fā)酵液的生物活性測定結(jié)果

采用單層杯碟法測定發(fā)酵液上清及菌體浸提液抑菌活性的結(jié)果見表3。由表可見1號(hào)放線菌的發(fā)酵液上清及菌體浸提液對(duì)枯草芽孢桿菌和藤黃微球菌均有抑制活性，對(duì)藤黃微球菌的抑制活性略大于枯草芽孢桿菌，發(fā)酵液上清活性略大于菌體浸提液。

表3 發(fā)酵液上清及菌體浸提液對(duì)枯草芽孢桿菌和藤黃微球菌的抑制作用Table3 Inhibition of supernatant and mycelium extract on Bacillus subtilis and Micrococcus luteus (mm)

2.5 發(fā)酵液中抑菌物質(zhì)穩(wěn)定性試驗(yàn)

2.5.1 溫度對(duì)1號(hào)放線菌發(fā)酵液上清以及菌體浸提液活性的影響

通過對(duì)1號(hào)放線菌發(fā)酵液上清和菌體浸提液在不同溫度下處理不同時(shí)間后，其抑菌圈直徑如表4～6所示。

由以上結(jié)果可知，在50℃水浴條件下處理發(fā)酵液上清1 h后，其抑菌活性基本喪失；而菌體浸提液經(jīng)過90℃水浴處理1.5 h后活性穩(wěn)定。

2.5.2 pH對(duì)1號(hào)放線菌發(fā)酵液上清以及菌體浸提液活性的影響

1號(hào)放線菌發(fā)酵液上清和菌體浸提液在不同pH下，其抑菌活性變化如表7所示。

表4 不同溫度處理下1號(hào)放線菌發(fā)酵液上清對(duì)枯草芽孢桿菌及藤黃微球菌的生長抑制Table4 Inhibition of supernatant on Bacillus subtilis and Micrococcus luteus under different temperature (mm)

表5 不同溫度處理下1號(hào)放線菌菌體浸提液對(duì)藤黃微球菌的生長抑制Table5 Inhibition of mycelium extract under on Micrococcus luteuss different temperature (mm)

表6 不同溫度處理下1號(hào)放線菌菌體浸提液對(duì)枯草芽孢桿菌的生長抑制Table6 Inhibition of mycelium extract treatments on Bacillus subtilis under different temperature (mm)

表7 不同pH下1號(hào)放線菌發(fā)酵液上清以及菌體浸提液對(duì)枯草煙包桿菌及藤黃微球菌的生長抑制Table7 Inhibition of supernatant and mycelium extract on Bacillus subtilis and Micrococcus luteus under different pH (mm)

由此可知，發(fā)酵液上清活性受pH影響變化較大，pH達(dá)到4以下或者9以上都會(huì)使其失活。而菌體浸提液活性受pH影響變化較小，即使在pH達(dá)到2或11的條件下也能保持穩(wěn)定的活性。

2.6 1號(hào)放線菌的16SrDNA鑒定

對(duì)1號(hào)放線菌的16S rDNA序列（1520bp）進(jìn)行測序，并與GenBank中16S rDNA序列進(jìn)行比對(duì)，其同鏈霉菌Streptomyces griseus的相似性達(dá)到99%。采用Clustalx 1.81軟件，用N-J法建立系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖4所示，對(duì)其進(jìn)行分析，二者之間的進(jìn)化距離相隔較近。結(jié)合對(duì)1號(hào)放線菌的形態(tài)觀察，進(jìn)一步確定1號(hào)放線菌屬于鏈霉菌屬拉丁文。

圖4 1號(hào)放線菌的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 16S rDNA phylogenetic tree of the No.1 actinomycete

3 討論與結(jié)論

本研究以對(duì)鏈霉素、慶大霉素及利福平的抗性為指標(biāo)，從不同地域采集的土樣中分離得到1株對(duì)以上三種抗生素具有較高抗性的菌株（1號(hào)放線菌），其對(duì)鏈霉素、慶大霉素和利福平的抗性分別為40、10和150μg·mL-1。經(jīng)三重抗生素篩選后，該放線菌對(duì)枯草芽孢桿菌和藤黃微球菌的抑菌活性得到了極大的提高。雖然多重抗生素抗性可增強(qiáng)放線菌的生物活性的機(jī)制不十分清楚，但據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，放線菌對(duì)鏈霉素、慶大霉素和利福平抗性的產(chǎn)生與編碼核糖體S12的基因rpsL和編碼16S rRNA甲基轉(zhuǎn)移酶的基因rsmG，以及編碼RNA聚合酶β亞基的基因rpoB的突變有關(guān)[20-22]。這些基因的突變可增強(qiáng)微生物次級(jí)代謝基因簇的轉(zhuǎn)錄和翻譯活性或激活沉默的基因簇，進(jìn)而提高抗生素的產(chǎn)量和產(chǎn)生新的抗生素[9-13,20-22]。對(duì)于1號(hào)放線菌在經(jīng)抗生素抗性篩選前后抗菌活性的變化是否由于rpsL、rsmG和rpoB的突變而引起，需要經(jīng)進(jìn)一步的PCR驗(yàn)證。對(duì)1號(hào)放線菌的發(fā)酵條件及活性物質(zhì)進(jìn)行了初步研究，結(jié)果顯示具有抗菌活性的代謝產(chǎn)物主要集中于發(fā)酵液上清液中，且對(duì)酸堿和溫度的敏感性較高，由此判斷1號(hào)放線菌所產(chǎn)生的抗菌活性物質(zhì)很可能是蛋白質(zhì)或肽類抗生素[23-24]。目前已有多種具有生物活性的肽類或蛋白類抗生素從多種微生物（如枯草芽孢桿菌、乳酸菌、放線菌）中分離和鑒定，它們對(duì)植物病原真菌和一系列的革蘭氏陽性菌及革蘭氏陰性菌具有較好的抑制作用，并在人類的疾病防治方面顯示出較好的潛力[25-27]。

本試驗(yàn)結(jié)果表明1號(hào)放線菌菌可產(chǎn)生具有抗菌活性的代謝產(chǎn)物，關(guān)于活性代謝物的分離鑒定還有待于進(jìn)一步的研究。

綜上所述，本研究證實(shí)利用三重抗生素抗性篩選可以通過激活微生物中沉默的基因而提高活性代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量或產(chǎn)生新的活性代謝物，從而增強(qiáng)微生物的生物活性。該方法為高效利用放線菌資源以及開發(fā)放線菌產(chǎn)生活性物質(zhì)的潛能提供了新的思路和途徑。

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