楊淼 劉玉玉 李淑娟

黃芪注射液對內毒素誘導大鼠腸系膜微循環(huán)障礙改善作用的實驗研究

楊淼 劉玉玉 李淑娟

目的探討靜脈給予黃芪注射液對內毒素血癥腸系膜微循環(huán)障礙的改善作用。方法Wistar大鼠30只為對照組、模型組、治療組，每組10只。采用靜脈注入脂多糖(LPS)(5 mg·kg-1·h-1)復制內毒素血癥模型，治療組給予靜脈注射黃芪注射液(5 ml·kg-1·h-1)，用微循環(huán)觀察系統(tǒng)每20分鐘動態(tài)觀察細靜脈粘附白細胞，細靜脈血管壁過氧化物的動態(tài)變化。在100 min觀察結束后，計數(shù)腸系膜間質內肥大細胞脫顆粒率。取外周血，用流式細胞儀測定粒細胞粘附分子CD 11b和CD18的表達。結果 模型組在LPS滴注20 min后，黏附于大鼠腸系膜細靜脈壁上的白細胞數(shù)和管壁過氧化物依存的DHR的熒光強度顯著增加，100 min時計數(shù)腸系膜間質內肥大細胞脫顆粒率顯著地增加(P＜0.05)。流式細胞儀測定外周血粒細胞黏附分子CD11b和CD18的表達明顯增加(P＜0.05)。治療組白細胞與腸系膜細靜脈的血管壁黏附;細靜脈壁過氧化物依存的DHR熒光強度的增加，腸系膜間質內肥大細胞脫顆粒率，外周血粒細胞黏附分子CD11b和CD18的表達明顯受到抑制(P＜0.01)。結論 黃芪注射液對內毒素血癥腸系膜微循環(huán)障礙有改善作用?？赡芷湟种屏＜毎じ椒肿覥D11b和CD18表達及肥大細胞脫顆粒相關。

黃芪注射液;脂多糖;微循環(huán)障礙;白細胞黏附;肥大細胞脫顆粒;黏附分子

重癥感染引發(fā)的膿毒癥及多臟器功能不全仍是目前ICU患者的主要死亡原因之一［1］。目前臨床上對膿毒性休克的治療措施包括抗生素的早期應用，充分的液體容量復蘇，血管活性藥物的應用，恰當?shù)妮斞べ|激素的應用，血糖的控制等一系列綜合方案［2］。盡管如此，膿毒性休克的病死率仍為30%～50%［3，4］，原因在于復蘇過程中只強調全身的氧代謝及血流動力學的恢復，而忽略對微循環(huán)的復蘇，事實上在膿毒癥病理生理學過程中，不同時期、不同器官血流灌注程度不一，會出現(xiàn)區(qū)域性血流分布不均勻現(xiàn)象［5］。Ince［6］研究表明即使全身性的氧供恢復正常，局部組織細胞仍存在缺氧及氧攝取障礙，如果這種情況持續(xù)不緩解，將會造成線粒體的損傷，發(fā)生微循環(huán)及線粒體窘迫綜合征(microcirculatory and mitochondrial distress syndrome，MMDS)。因此膿毒癥的發(fā)病機制及環(huán)節(jié)非常復雜，微循環(huán)障礙是膿毒癥時的重要病理生理基礎，改善微循環(huán)的治療必將對膿毒癥的預后有重要影響。本實驗旨在應用脂多糖(LPS)復制內毒素血癥大鼠腸系膜微循環(huán)障礙模型，并應用黃芪注射液給予治療，觀察黃芪注射液對腸系膜微循環(huán)障礙的影響，并對機制進行探討。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器:倒置生物顯微鏡(Nikon BCLIPSE Ti-u，Japan);CCD彩色攝像機(Nikon BCLIPSE Ti-u，Japan);監(jiān)視器(J2118A，TCL，China);CD 錄像機(DVR-R25，Malata，China);流式細胞儀(FACS Aria，B.D.Co，USA);時間記錄器(Video Timer VTG-55B，F(xiàn)OR-A，Japan)。

1.1.2 試劑:LPS購于上海前塵生物有限公司(Sigma公司生產，美國)，用前以0.9%氯化鈉溶液溶解為10 mg/ml;黃芪注射液由哈爾濱圣泰制藥股份有限公司(批號:223020822)提供，0.9%氯化鈉溶液由北京雙鶴藥業(yè)有限公司提供(批號:20080223)，抗體:FITC-標記的抗 CD18抗體，F(xiàn)ITC-標記的抗-CD11抗體，購于BD biosciences Pharmingen(USA);溶血素:購于美科美(北京)生物醫(yī)學科技中心(BD biosciences Immunocytometer Systems生產，USA);甲苯胺藍，二氫羅達明均購于北京華美生科生物技術有限公司(Sigma Chemical Co生產，St Louis，MO，USA)。

1.2 實驗動物 Wistar大鼠30只，雄性，體重320～250 g，由河北北方學院動物中心提供，實驗前禁食給水12 h，以烏拉坦肌肉麻醉(1.25 g/kg)。麻醉充分后，分別經左側頸靜脈及股靜脈置入3Fr靜脈置管用于給藥［10］。隨機分為3組:正常組(n=10):0 min開始經由股靜脈連續(xù)滴注0.9%氯化鈉溶液(1 ml/h)，20 min后經左頸靜脈連續(xù)注射0.9%氯化鈉溶液(5 ml·kg-1·h-1)，每 20分鐘動態(tài)觀察微循環(huán)狀態(tài)至100 min。模型組(n=10):0 min開始經由股靜脈連續(xù)滴注LPS(5 mg·kg-1·h-1)，20 min后經左頸靜脈連續(xù)0.9%氯化鈉溶液(5 ml·kg-1·h-1)，每20分鐘動態(tài)觀察微循環(huán)狀態(tài)至100 min［7］。治療組(n=10):0 min開始經由股靜脈連續(xù)滴注LPS(5 mg·kg-1·h-1)，20 min后經左頸靜脈連續(xù)注射黃芪注射液(5 ml·kg-1·h-1)，每20分鐘動觀察微循環(huán)狀態(tài)至100 min。

1.3 體內微循環(huán)觀察方法 剪去腹部毛發(fā)沿腹部正中作2～3 cm的切口，暴露小腸。將大鼠仰臥在觀察板上，輕輕提出小腸(回盲部向口側10～15 cm)，并將小腸展開放在有觀察孔的觀察板上，在表面連續(xù)滴加37℃ 0.9%氯化鈉溶液保持溫度和濕度，用配有37℃恒溫裝置的倒置生物顯微鏡進行觀察。通過連接在顯微鏡上的CCD彩色攝像機在顯示屏上觀察，用CD錄像機連續(xù)記錄微循環(huán)的變化。在10 min基礎觀察結束后，開始推注藥物，并將時間記錄器設定為0 min，并記錄圖像即為初始狀態(tài)，此后每隔20 min為觀察點，記錄血管圖像至100 min［8］。

1.4 圖像分析 選直徑30～50 μm，長200 μm無分支、無明顯彎曲的腸系膜細靜脈。

1.4.1 黏附于細靜脈壁白細胞數(shù)的計數(shù):在回放的CD錄像上，以停留在細靜脈同一位置超過10 s的白細胞視為黏附的白細胞，分別計數(shù)給藥前0～100 min，黏附于選定的大鼠腸系膜細靜脈壁上的白細胞數(shù)，用黏附白細胞數(shù)(個)/200 μm細靜脈表示［8］。

1.4.2 細靜脈壁DHR熒光強度的測定:在所觀察的大鼠腸系膜表面連續(xù)滴加感受H2O2的熒光探針DHR(10 μmol/L)，檢測血管壁氧化應激的反應4。用倒置熒光顯微鏡觀察，455 nm激發(fā)光，汞燈作為發(fā)射光源(100 W)27。用CD錄像機分別記錄3組給藥前0～100 min時的圖象，用Image-Pro Plus 5.0軟件測定細靜脈管壁及血管外間質的熒光強度。用0 min時細靜脈管壁與血管外間質的差為基礎值，計算各時間點數(shù)值與0 min的比值，用以表示大鼠腸系膜細靜脈管壁DHR熒光強度的變化率［8］。

1.4.3 肥大細胞脫顆粒率的計數(shù):100 min觀察結束后，將0.1%甲苯胺藍滴加在所觀察的視野1 min，用0.9%氯化鈉溶液沖洗后，在×20物鏡下，沿細靜脈觀察5個視野，計算未脫顆粒和脫顆粒的肥大細胞的百分率［8］。

1.4.4 體內外周血粒細胞黏附分子CD11b和CD18表達的測定:3組大鼠連續(xù)微循環(huán)觀察結束后，腹主動脈取血，肝素抗凝(20 U/ml全血)。加入 1 μg FITC-標記的抗 CD18抗體或抗CD11b的抗體，室溫避光孵育20 min。以溶血素破碎紅細胞，用PBS洗滌細胞2次。流式細胞儀檢測平均熒光強度。分選5 000個外周血粒細胞細胞，計算各組CD11b和CD18的平均熒光強度［9］。

1.5統(tǒng)計學分析應用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件，計量資料以±s表示，采用F檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 黃芪注射液對黏附于大鼠腸系膜細靜脈白細胞數(shù)的影響正常組在100 min觀察結束時僅有少量的白細胞黏附于大鼠腸系膜細靜脈。模型組在觀察20 min時，黏附于大鼠腸系膜細靜脈白細胞數(shù)為(5.7±1.0)個/200 μm，明顯高與正常對照組。治療組在40 min時，顯著地抑制了白細胞與于大鼠腸系膜細靜脈壁的黏附。見表1。

表1 黃芪注射液對黏附于大鼠腸系膜細靜脈白細胞數(shù)的影響

2.2 黃芪注射液對大鼠腸系膜細靜脈管壁DHR熒光強度變化的影響 正常組在100 min觀察結束時，大鼠腸系膜細靜脈管壁僅有小量的DHR熒光強度的增強，而模型組LPS連續(xù)滴加20 min時，大鼠腸系膜細靜脈管壁DHR熒光強度顯著地增強，并隨著LPS連續(xù)滴加進一步增強。而治療組大鼠在40 min時腸系膜細靜脈管壁DHR熒光強度顯著下降。見表2。

2.3 黃芪注射液對大鼠腸系膜間質內肥大細胞脫顆粒率的影

表2 黃芪注射液對大鼠腸系膜細靜脈管壁DHR熒光強度變化的影響

響

正常組觀察100 min結束時，大鼠腸系膜細靜脈周圍間質內肥大細胞脫顆粒率為(24±5)%，模型組的大鼠腸系膜細靜脈周圍間質內肥大細胞脫顆粒率為(51±6)%，高于正常組(P＜0.05)。治療組的大鼠腸系膜細靜脈周圍間質內肥大細胞脫顆粒率為(24±6)%，低于模型組(P＜0.05)。見表3。

2.4 黃芪注射液對大鼠外周血粒細胞黏附分子CD18和CD11b表達的影響 正常組的外周血粒細胞黏附分子CD18和CD11b的平均熒光強度分別為(44.3±4.1)和(27.4±2.3)，LPS組的外周血粒細胞黏附分子CD18和CD11b的平均熒光強度上升至(75.8±4.1)和(55.0±4.1)，高于正常組(P ＜0.05)。見表3。

表3 黃芪注射液對大鼠大鼠外周血粒細胞黏附分子表達的影響

3 討論

實驗研究利用LPS可復制出經典的膿毒癥和膿毒性休克的微循環(huán)障礙模型［10］，LPS是存在于革蘭氏陰性菌外膜的一類物質，是內毒素的主要成分。LPS誘導的白細胞沿細靜脈壁滾動、與內皮黏附、過氧化物的產生，血管外周肥大細胞脫顆粒等是LPS引起組織損傷和多器官功能衰竭的重要環(huán)節(jié)之一［11］。黃芪為豆科植物蒙古黃芪或膜莢黃芪的干燥根，是臨床應用廣泛的中藥。始載于《神龍本草經》，主要功效為補氣固表、利尿脫毒、排膿、斂瘡生肌，廣泛應用心、腦血管疾病及糖尿病相關并發(fā)癥等疾病的輔助治療［12］。但是有關黃芪對于內毒素血癥時微循環(huán)障礙的研究卻罕見報道。

本研究證明了內毒素血癥大鼠腸系膜微循環(huán)可觀察到白細胞與腸系膜細靜脈的黏附、血管壁過氧化物產生增加等變化，上述改變與時間呈線性關系，且與正常組差異有統(tǒng)計學意義。此外本試驗還發(fā)現(xiàn)，在實驗結束后，肥大細胞脫顆粒率、外周血粒細胞CD11b/CD18的表達表達明顯增加，黃芪注射液可以顯著抑制LPS引起白細胞與腸系膜細靜脈的黏附、血管壁過氧化物產生、肥大細胞脫顆粒、外周血粒細胞CD11b/CD18的表達。證明了黃芪注射液對LPS引發(fā)的微循環(huán)障礙具有一定的改善作用。

內毒素血癥可造成嚴重的膿毒癥，由于膿毒癥引發(fā)的低血壓可導致微循環(huán)灌注的下降，后者與臟器功能不全及多臟器功能衰竭的發(fā)生有關［13］，因此改善膿毒性休克時臟器微循環(huán)障礙是治療膿毒性休克及防治多臟器功能綜合征發(fā)生的關鍵［14］。

LPS可誘導粒細胞黏附分子CD11b/CD18的表達增強，其與配體血管內皮黏附因子-1(ICAM-1)的結合，在白細胞與內皮細胞黏附以及游出過程中起著決定性的作用［15］，白細胞-內皮細胞相互作用產生的過氧化物和釋放的炎性介質可以損傷血管內皮和血管基底膜，導致血漿白蛋白的漏出［16］。此外，LPS還可與肥大細胞TLR-4結合，依賴性地釋放腫瘤壞死因子-α的，白介素-1β，白介素-6，干擾素等炎性因子［17］，攻擊血管壁，促進內皮細胞VCAM-1和E-selectin的表達［18］，從而促進白細胞在血管內皮滾動和黏附。本研究證明了黃芪注射液對LPS體內誘導的白細胞-內皮細胞相互作用具有抑制作用，其機理可能與抑制細胞黏附分子CD11b/CD18的表達有關。

DHR是羅達明的前體，與H2O2等過氧化物反應后轉化成可發(fā)熒光的羅達明，并結合在細胞的線立體膜上［19］。用熒光顯微鏡可連續(xù)地觀察到DHR轉化成羅達明的發(fā)光部位和熒光強度，借以判斷過氧化物的動態(tài)產生［20］。本研究證明了黃芪注射液對LPS引起的大鼠腸系膜細靜脈血管壁過氧化物依存性發(fā)光的DHR熒光強度有明顯抑制作用。

總之，黃芪注射液可以通過抑制LPS誘導白細胞與血管壁的黏附，抑制粒細胞黏附分子CD11b/CD18的表達，抑制過氧化物的產生等多環(huán)節(jié)、多靶點改善微循環(huán)障礙，為臨床治療膿毒癥提供一些新的思路。

1 Cross AS，Opal SM.A new paradigm for the treatment of sepsis:is it time to consider combination therapy.Ann Intern Med，2003，138:502-505.

2 Dellinger RP，Carlet JM，Masur H，et al.Surviving Sepsis Campaign guidelines for management of severe sepsis and septic shock.Crit Care Med，2004，32:858-873.

3 Engel C，Brunkhorst FM，Bone HG，et al.Epidemiology of sepsis in Germany:results from a national prospective multicenter study.Intensive Care Med，2007，33:606-618.

4 Harrison DA，Welch CA，Eddleston JM.The epidemiology of severe sepsis in England，Wales and Northern Ireland，1996 to 2004:secondary analysis of a high quality clinical database，the ICNARC Case Mix Programme Database.Crit Care，2006，10:R42.

5 Spronk PE，Ince C，Gardien MJ，et al.Microcircualtion in distress:A new resuscitation end point?Crit Care Med，2004，32:1963-1964.

6 Ince C.The microcirculation is the motor of sepsis.Crit Care，2005，9:S13-S19.

7 Yuan Q，Liu YY，Sun K，et al.Improving effect of pretreatment with yiqifumai on LPS-induced microcirculatory disturbance in rat mesentery.Shock，2009，32:310-316.

8 Sun K，Wang CS，Guo J，et al.Effect of Astragalus Injections on lipopolysaccharide-induced adhesion of leukocytes in rat mesenteric venules.Clin Hemorheol Microcirc，2006;34:103-108.

9 Fujita Y，Habazettl H，Corso CO，et al.Comparative effects of hypotension due to isoflurane，nitroglycerin，and adenosine on subendocardial microcirculation:observation of the in situ beating swine heart under critical stenosis.Anesthesiology，1997，87:343-353.

10 張秋金，李銀平，黎檀實.肺泡上皮細胞功能特性與內毒素急性肺損傷.中國危重病急救醫(yī)學，2005，17:382-384.

11 Wu X，Yoshida A，Sasano T，et al.Histamine production via mast cell-independent induction of histidine decarboxylase in response to lipopolysaccharide and interleukin-1.Int Immunopharmacol，2004，4:513-520.

12 國家藥典委員會主編.中華人民共和國藥典(一部).北京:化學工業(yè)出版社，2000.249-250.

13 Darley-Usmar V，Halliwell B.Blood radicals:reactive nitrogen species，reactive oxygen species，transition metal ions，and the vascular system.Pharm Res，1996，13:649-662.

14 Cutrn JC，Perrelli MG，Cavalieri B，et al.Microvascular dysfunction induced by reperfusion injury and protective effect of ischemic precondi-tioning.Free Radic Biol Med，2002，33:1200-1208.

15 原慶，張淑文，羅國燕.膿毒癥引發(fā)的微循環(huán)障礙及中西藥的改善作用.中國中西醫(yī)結合急救雜志，2008，15:313-315.

16 Ikeda T，F(xiàn)unaba M.Altered function of murine mast cells in response to lipopolysaccharide and peptidoglycan.Immunol Lett，2003，88:21-26.

17 Mc Curdy JD，Lin TJ，Marshall JS.Toll-like receptor 4-mediated activation of murine mast cells.J Leukoc Biol，2001:977-984.

18 Darley-Usmar V，Halliwell B.Blood radicals:reactive nitrogen species，reactive oxygen species，transition metal ions，and the vascular system.Pharm Res，1996，13:649-662.

19 Hempel SL，Buettne GR，O'Malley YQ，et al.Dihydrofluorescein diacetate is superior for detecting intracellular oxidants:comparison with 2'，7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate，5(and 6)-carboxy-2'，7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate，and dihydrorhodamine 123.Free Rad Biol Med，1999，27:146-159.

Experimental study on the improvement effect of Astragalus injection on the endotoxin-induced mesentery

microcirculatory disturbance in rats

YANG Miao* ，LIU Yuyu，LI Shujuan．*Emergency Department，The First Hospital Affiliated to Hebei North College，Hebei，Zhangjiakou 075000，China

ObjectiveTo observe the improvement effect of Astragalus injection on the endotoxin-induced mesentery microcirculatory disturbance in rats with endotoxemia.Methods30 Wistar rats were randomly divided into control group，model group，treatment group，10 rats in each group.The endotoxemia models were established by intravenous injection with lipopolysaccharide(LPS)(5 mg·kg-1·h-1)，then the rats in treatment group were given Astragalus injection intravenously(5 ml·kg-1·h-1)，and the Microcirculationobservation system was used to observe the number of adherent leukocytes on minute veins and the changes of superoxide on the venular wall at an interval of 20min.After 100-minute observation，the mastocyte degranulation rate in mesenterium was calculated.The expression of CD11b and CD18 in peripheral blood was detected by flow cytometry.ResultsThe number of leukocytes adherent to venular wall，the intensity of hrdrogen peroxide(H2O2)dependent dihydrorhodamine 123(DHR)fluorescence in the venular walls were increased significantly after 20min of LPS infusion，and the mastocyte degranulation rate was increased significantly after 100min(P ＜0.05).The expression of CD11b/CD18 was obviously increased(P＜0.05).However the parameters as mentioned above in treatment group were significantly inhibited(P＜0.01).ConclusionAstragalus injection has the improvement effect on the mesentery microcirculatory disturbance in rats with endotoxemia，which may be correlated with its inhibition effect on the expression of CD11b/CD18 and the mastocyte degranulation.

Astragalus injection;lipopolysaccharide;microcirculatory disturbance;leukocyte adhesion;mastocyte degranulation;leukocyte adhesion molecules

R 255.7

A

1002-7386(2011)09-1290-04

10．3969/j．issn．1002-7386．2011．09．003

075000 河北省張家口市，河北北方學院附屬第一醫(yī)院急診科(楊淼)，心電圖室(劉玉玉);河北北方學院藥理教研室(李淑娟)

2010-12-08)

·論著·