鞏 陽，林一帆△，王長洪，王立新，麻樹人，陸宇平，高文艷，劉 楊，季 芳

膽石癥是一種常見病，在我國膽總管結(jié)石的發(fā)病率較高，占全國膽結(jié)石患者的5% ～29%，平均18%［1］。目前主要采取外科手術(shù)或內(nèi)科介入治療膽總管結(jié)石，安全、有效，但術(shù)后患者結(jié)石再發(fā)幾率高，約為6.4% ～18%［2］，所以膽總管結(jié)石的再發(fā)給病人帶來很大的負擔，如何防治膽總管結(jié)石已成為當前的熱點和難點。近年來，我們通過應(yīng)用加減化石利膽湯治療膽總管結(jié)石療效顯著［3］，為進一步探討此湯劑對成石機制的影響，我們展開以下研究。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

本組100例患者均為來自沈陽軍區(qū)總醫(yī)院中醫(yī)科2009年9月至2010年10月的住院患者，男58例，女42例，年齡28歲至80歲，平均56歲±26歲。

1.1.1 納入標準 (1)超聲或腹部 CT、MRI、MRCP等明確診斷為膽總管結(jié)石;(2)經(jīng)ERCP取石術(shù)后;(3)術(shù)前1個月內(nèi)未服用利膽藥物。

1.1.2 排除標準 (1)肝硬化;(2)免疫性疾病;(3)嚴重腎臟疾病;(4)膽道狹窄;(5)十二指腸乳頭良性狹窄的患者。

1.2 材料

1.2.1 試劑 化石利膽湯藥物組成:茵陳30g，威靈仙 10g，金錢草 30g，厚樸 15g，枳實 15g，梔子 10g，柴胡10g，雞內(nèi)金15g，莪術(shù)15g，均由沈陽軍區(qū)總醫(yī)院中藥局提供，廣東一方制藥廠生產(chǎn);焦炭酸二乙酯(DEPC)，由博爾美生物制劑公司提供;人血RNA提取試劑盒、Taq聚合酶(5U/ul)，寶生物工程(大連)有限公司;逆轉(zhuǎn)錄酶、核糖核酸抑制劑、DNA標記物(DL2000)、CYP7A1、B-UGT 抗體，SIGMA 公司。

1.2.2 主要儀器 －85℃型號超低溫冰箱(德國Hereaus公司);PCR基因擴增儀(美國 Bio-Rad公司);紫外線投射反射照相儀與計算機圖像分析系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)。

1.3 方法

1.3.1 分組按隨機非雙盲(隨機號碼數(shù)字表法1∶1入組) 服藥組50例和對照組50例，兩組病人在年齡、性別、病情、病程差異上均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。服藥組于ERCP取石術(shù)后常規(guī)給予抗炎、保肝、抑酸、抑酶等西醫(yī)治療，于術(shù)后第1d給予加減化石利膽湯100ml口服，3次/d，餐后30min服藥，連續(xù)口服1個月。對照組于ERCP取石術(shù)后除上述常規(guī)西醫(yī)治療外不給予任何其他治療，2組患者術(shù)后飲食均合理配餐，均衡膳食。

1.3.2 標本采集 2組均于患者行ERCP取石術(shù)后第1天，服藥后第7天及1個月采血，常規(guī)靜脈采全血2ml于含EDTA抗凝負壓抽血管中，顛倒混勻保存于－70℃冰柜;且每個患者均在術(shù)后留置鼻膽管，遂在術(shù)后第1、7天留取清晨空腹時鼻膽管膽汁，去除被血液污染或呈明顯膿性的膽汁標本，于－20℃冰箱保存。血及膽汁中指標的檢測均在沈陽藥科大學生命科學與生物制藥學院完成。

1.3.3 血mRNA檢測 Trizol方法提取血液白細胞中總 RNA，反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA，配制反應(yīng)體系:MgCl2(25mM)6μl，10 × RNA PCR Buffer 8μl，滅菌蒸餾水 63.5μl，TaKaRa Taq(5U/μl)0.5μl，上游PCR引物1μl，下游 PCR 引物 1μl。引物序列為:人膽紅素尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶(bilirubin UDP-glucronosyltransferase，B-UGT):上 游 引 物 5'-GAATTTGAAGCCTACATTAATGCTTCTGGAGAACAT-3'和下游引物5'-TCACATCTGTCTTCCTGACTGC-3'，引物擴增產(chǎn)物為546bp片段;人膽固醇7α羥化酶(CYP7A1)，上 游 引 物 5’F-GCCCAACTAG AGAATCTCTG -3'和下游 引物 5'FAGATGTACAACATCTCATTC-3'。GAPDH:上 游 引物5'-TATTGGGCGCCTGGTCACCA-3'和下游引物5'-CCACCTTCTTGATGTCATCA-3'，引物擴增產(chǎn)物為726bp片段。

把上述80ul反應(yīng)液加入到20μl反轉(zhuǎn)錄結(jié)束后的PCR反應(yīng)管中，輕輕混勻，按以下條件進行PCR反應(yīng):變性 94℃ 30sec，退火 48℃ 30sec，延長 72℃1.5min，30個循環(huán)。PCR產(chǎn)物在含0.5mg/L EB的1%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像分析系統(tǒng)作密度分析，目的基因的表達通過GAPDH的表達量作標準化處理，即半定量，然后計算各標本目的基因表達半定量的比值，各標本重復(fù)3次取均值。

1.3.4 Western blot檢測蛋白表達 細胞收集于EP管中，加入蛋白裂解液和蛋白酶抑制劑，超聲破碎細胞，離心后提取蛋白，考馬斯亮藍法測蛋白濃度，蛋白上樣量為80μg，體系為20μl。配制12%聚丙烯酰胺凝膠，煮樣后電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉(5%脫脂牛奶)，一抗4℃孵育過夜(CYP7A1為1∶500稀釋，B-UGT為1∶500稀釋)，洗膜45min，加入過氧化物酶標記的二抗，室溫孵育2h后electrochemiluminescence(ECL)發(fā)光，應(yīng)用Metamorph軟件計算光密度值。將每組服藥前空白組的光密度值設(shè)為參考值，將其他組的光密度值與其相比得到的比值，即半定量，各標本重復(fù)3次，取均值。

1.4 統(tǒng)計學方法

以第三方盲態(tài)評價法，數(shù)據(jù)以珋x±s表示，采用SPSS 15.0統(tǒng)計軟件，χ2檢驗，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 人血CYP7A1、B-UGT mRNA表達變化

比較2組治療前 CYP7A1、B-UGT的 mRNA表達，無明顯統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。服藥組服藥后第7天、1個月 CYP7A1、B-UGT的 mRNA表達明顯強于服藥前，明顯強于同一時期對照組(P＜0.05，表1圖 1、2)，而對照組服藥前后 CYP7A1、B-UGT mRNA的表達無差異。

2.2 人膽汁中CYP7A1、B-UGT蛋白表達變化

比較2組治療前CYP7A1、B-UGT的蛋白表達，無明顯統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。服藥組服藥后第7d CYP7A1、B-UGT的蛋白表達明顯強于服藥前，明顯強于同一時期的對照組(P＜0.05，表2圖3、4)，對照組服藥前后膽汁中的 CYP7A1、B-UGT的蛋白表達無差異。

表1 不同時期兩組病人血中CYP7A1、B-UGTm RNA表達

3 討論

圖1 血B-UGT m RNA表達變化

圖2 血CYP7A1 m RNA表達變化

表2 不同時期兩組病人膽汁CYP7A1、B-UGT蛋白表達

膽結(jié)石按成石部位分類，可分為膽囊結(jié)石、肝內(nèi)膽管結(jié)石、膽總管結(jié)石，其中膽總管結(jié)石的治療主要以ERCP等內(nèi)鏡介入治療為主，且取石的成功率也越來越高，但膽總管結(jié)石的復(fù)發(fā)問題仍是難點，目前能夠防石、溶石的西藥的報道主要為去氧膽酸等一類藥物，但因其價格昂貴，療效不明確，應(yīng)用受限。

中醫(yī)藥治療膽石癥歷史悠久，且療效顯著，近年來中醫(yī)藥學者結(jié)合現(xiàn)代醫(yī)學技術(shù)對多種中藥給予深入研究。如有文獻報道中藥升清膠囊可以干預(yù)大鼠肝組織中成石基因，即 B-UGTmRNA 和CYP7AlmRNA的表達，進一步干預(yù)膽紅素和膽固醇代謝，抑制致石性膽汁形成，起到預(yù)防膽結(jié)石的作用［4］。但中醫(yī)藥對于膽石癥的成石基因研究只有動物實驗，無臨床實驗研究，且尚無從膽汁或血液研究成石基因及其蛋白的表達。所以本課題從分子生物學方面研究加減化石利膽湯防治膽總管結(jié)石的機制，以便更好地指導(dǎo)預(yù)防工作。

膽結(jié)石的形成過程中，膽紅素和膽固醇為重要的成石物質(zhì)，因為它們分別是膽紅素和膽固醇代謝過程中重要的酶，B-UGT和 CYP7A1mRNA為2個重要的成石基因。膽結(jié)石根據(jù)形成的主要成分，可分為膽紅素結(jié)石、膽固醇結(jié)石、混合型結(jié)石。膽紅素結(jié)石的主要成分是游離膽紅素，所以游離型膽紅素對成石有重要意義［5］，而游離膽紅素是結(jié)合膽紅素水解后形成的，這個水解的過程主要依靠葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶(B-UGT)，所以膽汁中游離膽紅素的含量與B-UGT密切相關(guān)，于是 B-UGT的 mRNA表達水平可反映膽紅素結(jié)石的形成趨勢［6］。膽固醇結(jié)石中的主要物質(zhì)是膽固醇，內(nèi)源性的膽固醇代謝主要通過經(jīng)典途徑被代謝成膽汁酸，膽固醇7α羥化酶(CYP7A1)即是經(jīng)典途徑的起始酶，所以CYP7A1的活性代表著機體清除膽固醇的能力，也是膽固醇結(jié)石形成中重要的成石因素［7］。所以，監(jiān)測 B-UGT和CYP7A1mRNA的表達和蛋白表達，可以在很大程度上說明膽石成石趨勢。

圖3 膽汁B-UGT蛋白表達變化

圖4 膽汁CYP7A1蛋白表達變化

本課題組長期以來從事ERCP結(jié)合中醫(yī)藥治療膽總管結(jié)石的研究，其病例近2000人。10余年來，我們在臨床觀察中發(fā)現(xiàn)，口服化石利膽湯可以治療膽總管結(jié)石，且本實驗證實了口服化石利膽湯的患者血中B-UGT和CYP7A1的mRNA表達及膽汁中B-UGT和CYP7A1的蛋白表達明顯高于空白對照組，從而表明化石利膽湯很可能通過上調(diào)B-UGT和CYP7A1基因表達，使B-UGT和CYP7A1的蛋白表達增加，以減少結(jié)石形成。中藥對于膽總管結(jié)石進一步預(yù)防的研究，應(yīng)繼續(xù)進行長期的藥物臨床觀察，并對照相關(guān)膽石成石基因表達，選取有效的膽總管結(jié)石中藥。

［1］ 陳希綱，劉家奇，彭民浩，等.膽石病臨床流行病學調(diào)查—附8585 例分析［J］.中華普通外科雜志，2002，17(2):99-101.

［2］ Uchiyama K，Onishi H，Tani M，et al.Long-term prognosis after treatment of patients with choledocholithiasis［J］.Ann Surg，2003，238(1):97-102.

［3］ 鞏 陽，林一帆，麻樹人，等.耳針加化石利膽湯網(wǎng)籃取石術(shù)綜合治療膽總管結(jié)石的臨床研究［J］.中國中西醫(yī)結(jié)合消化雜志，2010，18(4):267-270.

［4］ 朱培庭，張靜拮，章學林，等.升清膠囊對豚鼠膽石病相關(guān)基因的影響［J］.中西醫(yī)結(jié)合學報，2005，5(3):207-210.

［5］ 吳階平，裘法祖主編.黃家駟外科學［M］.第6版.北京:人民衛(wèi)生出版社，2002:1282.

［6］ 楊文奇，祝學光，張紅軍，等.肝臟膽紅素葡萄糖醛酸化障礙對膽石形成的作用［J］.中華消化雜志，1999，19(1):67-68.

［7］ Rudllng M.Hepatic mRNA levels for the LDL receptor and HMG—COA reductase show coordinate regulation in vivo［J］.J Lipid Res，1992，33(4):493-501.