夏 偉,柳 詠

(江蘇省揚(yáng)州市第一人民醫(yī)院肝膽外科,江蘇揚(yáng)州,225000)

膽管癌是一種起源于膽管上皮細(xì)胞的惡性腫瘤,目前外科手術(shù)及放化療的療效均欠佳,根治術(shù)后5年生存率僅0～30%[1],對(duì)其病因及早期診斷治療的研究逐漸成為熱點(diǎn),有研究表明[2],氧化損傷、癌基因激活和減弱的細(xì)胞凋亡在發(fā)病中起作用。端粒酶可阻止端粒縮短,進(jìn)而阻止細(xì)胞凋亡,與惡性腫瘤的發(fā)生密切相關(guān),Bcl-2是一種有抑制細(xì)胞凋亡的癌基因,也與惡性腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)意欲研究:①膽汁中端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶及Bcl-2基因的表達(dá),明確其在膽管癌的早期診斷中的意義,并對(duì)2者的診斷意義加〗以比較;②探討端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶和Bcl-2基因在造成膽管癌發(fā)生發(fā)展中的關(guān)系,現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

40例膽汁標(biāo)本取自于本院2008年2月～2010年9月膽管癌及膽總管結(jié)石住院患者。膽總管結(jié)石膽汁標(biāo)本20例取自20例膽總管結(jié)石患者,在行ERCP取石過程中通過內(nèi)鏡取得;膽管癌膽汁標(biāo)本20例取自20例膽管癌患者,在行ER2 CP支架置入術(shù)中通過內(nèi)鏡取得。膽管癌患者中肝門部膽管癌13例,膽總管中下段癌7例;10例獲得手術(shù)的膽管癌患者中,按國(guó)際抗癌協(xié)會(huì)UICC標(biāo)準(zhǔn)分期:Ⅰ期0例,Ⅱ期4例,Ⅲ期5例,Ⅳ期1例,Ⅴ期0例。20例膽總管結(jié)石患者膽汁標(biāo)本作為對(duì)照組,20例膽管癌患者膽汁標(biāo)本作為試驗(yàn)組,2組患者一般資料差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,具有可比性。

圖1 hTERT基因擴(kuò)增后電泳結(jié)果圖(263bp長(zhǎng)度為hTERT基因。327bp長(zhǎng)度為內(nèi)對(duì)照,標(biāo)尺為DL2000)

圖2 Bcl-2基因擴(kuò)增后電泳結(jié)果圖(176bp長(zhǎng)度為Bcl-2基因。327bp長(zhǎng)度為內(nèi)對(duì)照,標(biāo)尺為DL2000)

1.2 研究方法

首先提取膽汁標(biāo)本中的總RNA(總RNA抽提試劑盒,華美生物工程有限公司),用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(ImPom-ⅡTM,Promega公司)合成cD2 NA,然后進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR),所用Bcl-2擴(kuò)增引物:上游引物:5′-GCATCTTCTC2 CTCGCAGCCC-3′,下游引物:5′-CACCAC2 CGTGGCAAAGCGTC-3′。所用端粒酶hTERT擴(kuò)增引物:上游引物:5′-ACGGCGACATGGA2 GAACAA-3′,下游引物:5′-CACTGTCTTC2 CGCAAGTTCAC-3′。內(nèi)對(duì)照β-actin引物:上游引物:5′-GATGGCCAGGTCATCACCATTG GC-3′,下游引物:5′-GAAGGTGGACAGT2 GAGGCCAGGAT-3′。擴(kuò)增引物由上海捷倍思生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。最后將目的基因擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳并進(jìn)行半定量分析。

2 結(jié) 果

2.1 膽管癌患者膽汁中hTERT與Bcl-2基因的擴(kuò)增電泳結(jié)果

膽管癌患者膽汁h(huán)TERT與Bcl-2基因擴(kuò)增結(jié)果見圖1、圖2。

2.2 hTERT與Bcl-2基因的表達(dá)結(jié)果

以電泳后出現(xiàn)目的基因電泳條帶為陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)。膽管癌患者膽汁中的hTERT基因陽(yáng)性(14/ 20),基因相對(duì)水平(0.326±0.185),而膽總管結(jié)石患者膽汁中hTERT基因無(wú)陽(yáng)性表達(dá),基因相對(duì)水平為(0.021±0.014),2組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。膽管癌患者膽汁中Bcl-2基因的陽(yáng)性率(11/20),基因相對(duì)水平(0.284± 0.156),膽總管結(jié)石患者膽汁中Bcl-2基因的陽(yáng)性(1/20),基因表達(dá)相對(duì)水平為(0.027±0. 019),2組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表1。

表1 端粒酶、Bcl-2在膽管癌和膽管良性病變中膽汁中的表達(dá)(n)

2.3 hTERT與Bcl-2基因的相關(guān)性

在20例膽管癌患者膽汁標(biāo)本中,端粒酶與Bcl-2的關(guān)系見表2。14例表達(dá)hTERT基因陽(yáng)性的膽管癌膽汁中,Bcl-2基因同時(shí)有陽(yáng)性表達(dá)的有9例,6例hTERT基因陰性的膽汁中Bcl-2基因也為陰性的有4例,2者之間無(wú)相關(guān)性。

3 討 論

端粒酶激活,端粒延長(zhǎng)是大多數(shù)腫瘤發(fā)生的共同事件,已被公認(rèn)為腫瘤發(fā)生發(fā)展的機(jī)制之一。研究發(fā)現(xiàn),端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)是端粒酶活性高低的限速?zèng)Q定因子,只有hTERT的表達(dá)與端粒酶活性密切相關(guān),近來陸續(xù)有報(bào)道[3-5]采用RT-PCR方法對(duì)人體某些惡性腫瘤包括頭頸部癌、肝癌、泌尿上皮癌、腸癌及乳腺癌等標(biāo)本進(jìn)行hTERT基因表達(dá)檢測(cè),結(jié)果均顯示腫瘤組織的hTERT基因表達(dá)量均顯著高于正常組織和良性病變組織。本實(shí)驗(yàn)采用膽汁標(biāo)本檢測(cè)端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因表達(dá),結(jié)果表明膽管癌基因高表達(dá),表達(dá)陽(yáng)性率70%,膽總管結(jié)石患者膽汁h(huán)TERT無(wú)表達(dá),本實(shí)驗(yàn)是檢測(cè)通過無(wú)創(chuàng)手段所采集的膽汁,結(jié)果如上,膽管癌患者膽汁中hTERT基因的表達(dá)高達(dá)(14/20),而膽總管結(jié)石患者膽汁中無(wú)hTERT基因表達(dá),差異顯著,說明對(duì)于膽管狹窄性質(zhì)不明通過檢測(cè)膽汁中hTERT基因的表達(dá)可對(duì)定性判斷提供幫助。況且通過內(nèi)鏡收取膽汁是無(wú)創(chuàng)手段,并可同時(shí)對(duì)需要減黃者做內(nèi)外引流處理,證實(shí)通過RT-PCR方法檢測(cè)膽汁中hTERT基因可成為診斷膽管癌的一種可取的方式,可作為影像學(xué)檢查和活檢等的補(bǔ)充手段,進(jìn)一步提高膽管癌的診斷水平。

國(guó)內(nèi)資料顯示[6],Bcl-2基因在乳腺癌中的表達(dá)顯著高于正常乳腺組織。關(guān)于Bcl-2于膽管癌的關(guān)系也逐漸被認(rèn)識(shí)。細(xì)胞凋亡障礙(尤其是Bcl-2凋亡途徑異常)在膽管癌發(fā)生和發(fā)展中的作用已開始受到關(guān)注,國(guó)外學(xué)者對(duì)肝膽及其腫瘤Bcl-2表達(dá)的免疫組化研究顯示[7],肝內(nèi)膽小管和小膽管上皮Bcl-2蛋白表達(dá)陽(yáng)性,肝細(xì)胞、肝內(nèi)大肝管及肝外膽道均為陰性,72.7%(8/11)的膽管癌表達(dá)陽(yáng)性,肝轉(zhuǎn)移性腺癌陽(yáng)性率為42. 8%(6/14)。15例肝細(xì)胞癌均為陰性,提出膽管細(xì)胞是肝膽祖細(xì)胞、Bcl-2蛋白表達(dá)是膽管癌的特征性標(biāo)志。本試驗(yàn)通過檢測(cè)到膽管癌患者膽汁中Bcl-2基因陽(yáng)性表達(dá)(11/20),顯著高于膽總管結(jié)石組(1/20),說明Bcl-2的過度表達(dá)可能在膽管癌的發(fā)生中起一定作用。本實(shí)驗(yàn)通過無(wú)創(chuàng)手段所采集的膽汁,膽管癌患者膽汁中Bcl-2的表達(dá)高于膽總管結(jié)石者,差異顯著,說明對(duì)膽管狹窄無(wú)法明確性質(zhì)的患者,通過檢測(cè)膽汁中Bcl-2可對(duì)定性診斷提供一定幫助。

由上可知,端粒酶通過阻止端粒縮短進(jìn)而阻止細(xì)胞凋亡,從而于惡性腫瘤密切相關(guān),Bcl-2通過多種途徑抑制細(xì)胞凋亡,也與惡性腫瘤密切相關(guān),但在腫瘤的發(fā)生過程中兩者的相互關(guān)系如何,文獻(xiàn)少有報(bào)道。有研究認(rèn)為[8],單純Bcl-2的過度表達(dá)可激活端粒酶。膽管癌的發(fā)生發(fā)展中2者的關(guān)系如何尚未見報(bào)道。本試驗(yàn)通過對(duì)每份膽管癌患者膽汁同時(shí)檢測(cè)hTERT基因和Bcl-2基因,以尋求兩者間的關(guān)系,結(jié)果顯示兩者無(wú)明顯相關(guān)的關(guān)系,其他腫瘤相關(guān)基因的作用還待進(jìn)一步研究。

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