秦俊哲， 郭云霞， 高存秀

(陜西科技大學生命科學與工程學院， 陜西 西安 710021)

0 引 言

銀杏(GinkgobilobaL.)是銀杏科銀杏屬的唯一生存種植物[1],銀杏黃酮是銀杏葉主要有效成分之一，現已從銀杏葉中分離鑒定出40余種黃酮類化合物，國內外大量研究證實,銀杏黃酮具有抗氧化、降血脂、提高免疫力、抗腫瘤、抗炎、鎮(zhèn)痛等方面的作用[2,3]，銀杏黃酮的藥理作用已臨床應用.本實驗將響應面分析應用于銀杏黃酮的乙醇提取法，以銀杏黃酮得率為響應值，采用多元二次回歸擬合出方程，得出最佳的提取條件.

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

材料 市售銀杏茶，試劑 標準品蘆丁(中國藥品生物制品檢定所，批號：100080-200707)，無水乙醇、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁等試劑均為分析純儀器 KQ-250DE型醫(yī)用數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，SP-752(PC)型紫外可見分光光度計(上海光譜儀器有限公司)

1.2 方法

表1 Box-Behnken因素水平表

1.2.1 測定方法[4]

準確稱取一定標準品蘆丁，70%乙醇溶解定容至50 mL，分別取0、1、2、3、4、5、6、7、8 mL加到25 mL容量瓶內，加1 mL 5%亞硝酸鈉，搖勻放置6 min,加1 mL 10%的硝酸鋁搖勻放置6 min,加入4 mL 4%的氫氧化鈉,然后用相應的乙醇溶液定容，搖勻,靜置15 min.在400～600 nm波長范圍內掃描得出最大吸收波長在510 nm，用最小二乘法將蘆丁標準液濃度與所得吸光度值做一元線性回歸分析，得標準曲線方程為A=11.54C-0.001 2,R2=0.999 7.

1.2.2 銀杏黃酮的提取[5]

準確稱取3.00 g銀杏茶粉末，料液比1∶30, 70%乙醇，70 ℃溫度下提取2.5 h,分別超聲波提取、微波提取、冷凝回流提取，過濾，冷卻定容，測定.

表2 響應面試驗設計及結果

2 結果與分析

2.1 響應面因素水平的設計及結果

對表2試驗結果通過SAS軟件程序進行二次回歸響應面分析，建立多元二次響應面回歸模型：Y=1.072 33-0.045 375A-0.019 5B+0.011 875C-0.021 917A2-0.023 75A×B-0.007A×C-0.008 667B2-0.010 25B×C-0.016 917C2.

2.2 響應面方差分析

由表3中可以看出，模型的F值為18.04，P值為0.002 7，P≤0.01，說明該模型具有高度顯著性；決定系數R2= 0.970 1，表明由此模型中可解釋97.01%的變異，說明此模型相關性良好；信噪比為13.922，表明該項響應面設計具有可行性，擬合度好.表3中決定系數A(乙醇濃度)、B(料液比)、C(提取時間)、AB(乙醇濃度與料液比的交互作用)的P值分為0.000 2、0.007 5、0.046 0、0.013 5，P≤0.05，對銀杏黃酮得率的影響具有顯著性.

表3 回歸模型的方差分析表

注：決定系數R2= 0.970 1，Adeq Precision(信噪比)=13.922.

圖1 乙醇濃度與料液比對銀杏黃酮得率影響的響應面圖及等高線圖

2.3 響應面分析

為了更直觀的表現兩個因素對銀杏黃酮得率的影響，以任意兩因素為考察對象，剩余因素水平取值為零，進行降維分析，得到二元二次方程會出響應面圖.本試驗中顯著的交互影響是AB，即乙醇濃度與料液比的交互作用對銀杏黃酮得率的影響.

圖2 乙醇濃度與提取時間對銀杏黃酮得率影響的響應面圖及等高線圖

圖3 料液比與提取時間對銀杏黃酮得率影響的響應面圖及等高線圖

從響應面的最高點和等高線可以看出在所選的范圍內存在極值，響應面的最高點同時也是等值線中的最小橢圓的中心點.由圖1可知AB的交互作用顯著，在所選范圍內，它們對Y值的影響規(guī)律隨著另一因素的改變有明顯變化；由圖2、3可看出，AC、BC交互作用不顯著，在所選范圍內，它們對Y值的影響規(guī)律隨著另一因素的改變沒有有明顯變化.3個因素對Y值的影響以及各因素之間的交互影響與回歸分析結果吻合.由上述3組圖可知，該回歸方程存在穩(wěn)定點，即極大值點.根據回歸方程，對A、B、C分別求偏導數，然后求解即得極大值點：乙醇濃度為80%，料液比為1∶39(g∶mL)，提取時間為2.8 h時銀杏黃酮得率達到最大值1.10%.驗證試驗得到實際銀杏黃酮得率為1.098%，與預測值比較吻合，說明回歸模型能夠真實地反映各因子對黃酮提取率的影響.

3 結束語

本試驗采用醇提法，以乙醇溶液為提取劑提取銀杏總黃酮，并用響應面設計優(yōu)化法進行優(yōu)化，得到最佳提取條件為：乙醇濃度為80%，料液比為1∶38.97，提取時間為2.79 h.在此條件下，黃酮的得率為1.101%.此方法設備簡單、成本低、見效快，適于工業(yè)化生產.

經響應面設計優(yōu)化后，可以找到各因素的最佳值，并獲得較理想的得率，同時，各因素間的相互作用對生產過程中工藝參數的設置提供了參考，響應面分析方法克服了傳統的數理統計方法數據量較大，無法考慮各因素的綜合作用的缺點，對實際生產更有指導意義，在生產和科研中必將有更加廣闊的應用前景.

參考文獻

[1] 夏曉暉,張 宇,郗硯彬.銀杏葉化學成分研究進展[J].中國實驗方劑學雜志，2009,15(9):100-104.

[2] 陳易彬,張 益,劉 藝.不同的處理方法對提取銀杏葉黃酮含量的影響[J].中國釀造，2010,(2):82-84.

[3] 劉宗敏,張 慧,戴梓茹.銀杏黃酮的生理作用研究現狀及發(fā)展前景[J].湖南林業(yè)科技,2006, 33(6):75-77.

[4] 苗 方.分光光度法對銀杏茶中總黃酮的含量測定[J].醫(yī)學理論與實踐,2009,(22):3.

[5] 郭雪峰,岳永德. 黃酮類化合物的提取、分離純化和含量測定方法的研究進展[J].安徽農業(yè)科學,2007,35(26):8 083-8 086.