王新朵， 李 莉， 王錫鋒

（植物病蟲害生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，北京 100193）

近年來我國(guó)主要農(nóng)作物病毒病發(fā)生的種類和面積不斷增加，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成了巨大損失。植物病毒是植物的活體寄生物，病毒病害素有“植物癌癥”之稱。對(duì)多數(shù)病毒病而言，以農(nóng)藥為基礎(chǔ)的常規(guī)防治方法無法從根本上解決問題［1］。因此，控制病毒病最為經(jīng)濟(jì)有效的途徑是利用品種自身抗性達(dá)到主動(dòng)防治的目的。然而傳統(tǒng)的育種方法由于缺乏理想的抗源，抗病基因又多與劣質(zhì)基因相伴隨，獲得抗病、高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)雙重特性品種的難度很大，很難在短時(shí)間內(nèi)取得突破，尋找有效的方法培育抗病、優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的作物新品系是當(dāng)務(wù)之急。

自從1983年轉(zhuǎn)基因植物誕生以來，植物轉(zhuǎn)基因工程發(fā)展勢(shì)頭始終不減，現(xiàn)已躍入大規(guī)模商業(yè)化生產(chǎn)階段，并成為發(fā)展最快、應(yīng)用潛力最大的生物技術(shù)領(lǐng)域之一。因此利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)創(chuàng)制免疫或高抗作物病毒病的新品系（品種）是解決嚴(yán)重威脅我國(guó)農(nóng)作物病毒病害的有效策略之一。

RNA干擾（RNA interference，RNAi）則是近年來發(fā)現(xiàn)的一種重要基因沉默現(xiàn)象，它是通過雙鏈RNA介導(dǎo)的特異性降解對(duì)應(yīng)序列的mRNA，從而抑制相應(yīng)基因的表達(dá)，是植物在長(zhǎng)期進(jìn)化過程中形成的對(duì)外來入侵者的一種重要的防御機(jī)制。RNAi普遍存在于各種生物，且在動(dòng)物、植物和真菌中都證實(shí)了其具有特異性、穩(wěn)定性、高效性、不改變?cè)谢蚪M遺傳組成及轉(zhuǎn)基因后不在植物體內(nèi)表達(dá)蛋白質(zhì)等優(yōu)點(diǎn)，其在植物遺傳改良，尤其是抗病毒育種等方面有著廣闊的應(yīng)用前景。

1 RNAi的作用機(jī)制及其在轉(zhuǎn)基因作物的應(yīng)用原理

1．1 RNAi的發(fā)現(xiàn)和作用機(jī)制模式

RNAi現(xiàn)象是1990年Jor gensen［2］等在轉(zhuǎn)基因植株中首先發(fā)現(xiàn)的，當(dāng)時(shí)這種同時(shí)抑制自身和相應(yīng)內(nèi)源基因表達(dá)的基因沉默現(xiàn)象被稱為基因的共抑制（co－suppression）。隨后諸多的研究報(bào)告了共抑制現(xiàn)象都是由核基因轉(zhuǎn)錄后形成的mRNA降解引起的［3］，確定為轉(zhuǎn)錄后基因沉默（posttranscriptional gene silencing，PTGS）。直到1998年，F(xiàn)ire等發(fā)現(xiàn)將雙鏈RNA（ds RNA）注入秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）可以引起特異性基因沉默，并將這一現(xiàn)象定義為RNA干擾。后來證明除了外源ds RNA引發(fā)RNAi外，內(nèi)源性ds RNA存在同樣的機(jī)制［4］。

在不同的生物體內(nèi)，不同的ds RNA引發(fā)的RNAi的詳細(xì)過程不盡相同，但RNAi有共同的作用模式。RNAi對(duì)基因表達(dá)的調(diào)節(jié)效應(yīng)最終通過3種方式發(fā)生作用：1）靶mRNA的降解；2）阻止mRNA的翻譯過程；3）RNA指導(dǎo)的DNA甲基化（RNA－directed DNA met hylation，Rd DM）。前兩種屬于PTGS，最后一種屬于TGS（transcriptional gene silencing）。其中以mi RNA通路發(fā)生的PTGS是RNAi最核心的沉默機(jī)制。在植物體內(nèi)，RNAi作用過程基本概括為：1）細(xì)胞核內(nèi)ds RNA的形成，包括由正義mRNA和反義mRNA結(jié)合成的ds RNA，由單條RNA回折互補(bǔ)形成的hp RNA（haipin－RNA）等；2）屬于RNaseⅢ類的Dicer或DCL（Dicer－like）識(shí)別 ds RNA 并進(jìn)行切割，產(chǎn)生5′－磷酸基團(tuán)，3′－OH 并突出2 nt的si RNA（s mall－interfering RNA）的雙鏈體，此雙鏈體解離后轉(zhuǎn)出細(xì)胞核［5］；3）si RNA或mi RNA與 AGO（Argonaute）等蛋白結(jié)合形 成 RISC（RNA－induced silencing co mplex），RISC尋找與自身復(fù)合體中的si RNA或mi RNA堿基配對(duì)的mRNA結(jié)合；4）RISC將mRNA切割成小片段，有時(shí)在不將mRNA切斷的情況下通過si RNA或Ar gonaute蛋白特異性阻止mRNA的翻譯［6］；5）釋放的si RNA以自身為引物，以mRNA為模板，在 Rd Rp（RNA－dependent RNA pol y merase）的作用下合成新的ds RNA；6）si RNA分子可以通過胞間連絲或韌皮部運(yùn)輸實(shí)現(xiàn)細(xì)胞、組織間的傳遞［7］。

除了mi RNA通路，擬南芥體內(nèi)還存在tasi RNA通路，nat－si RNA通路，rasi RNA通路。其中rasi RNA通路可以引發(fā)Rd DM，屬于TGS。

1．2 RNAi是一個(gè)廣泛存在的自然現(xiàn)象

已有研究表明，內(nèi)源性mi RNA也可以介導(dǎo)RNAi。在高等生物中，存在200種以上的miRNA，約占基因組的1%［8］。每個(gè)細(xì)胞中，可能存在幾百到上萬個(gè)這樣的分子［9］。在擬南芥中已發(fā)現(xiàn)了幾百種不同的siRNA［10］。細(xì)胞核中轉(zhuǎn)錄的原初mi RNA（pri mary－mi RNA）在ds RNA 結(jié)合蛋白（ds RBP）的參與下被DCL1切割成雙鏈體miRNA，雙鏈體miRNA被甲基轉(zhuǎn)移酶HEN1在3′甲基化修飾后在核輸出蛋白 HST（HASTY）的幫助下進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)［11－13］。在胞質(zhì)中，成熟的單鏈miRNA裝載AGO1后形成RISC，RISC靶向切割同源配對(duì)的mRNA。植物中mi RNA的RNAi途徑主要由靶mRNA的降解導(dǎo)致靶基因的低表達(dá)，哺乳動(dòng)物或昆蟲卻主要依賴mi RNA靶向mRNA的3′的UTR區(qū)互補(bǔ)配對(duì)從而影響mRNA的正常翻譯［14］。

自然界廣泛存在的RNAi現(xiàn)象解決了人們對(duì)RNAi技術(shù)的倫理學(xué)疑惑，極大地鼓舞了siRNA藥物和RNAi轉(zhuǎn)基因作物的開發(fā)應(yīng)用。目前，國(guó)際上已有幾個(gè)siRNA治療藥物被批準(zhǔn)進(jìn)入臨床試驗(yàn)［15］，RNAi技術(shù)在抗病毒轉(zhuǎn)基因作物中的應(yīng)用也已成為研究的熱點(diǎn)。

2 RNAi技術(shù)在抗病毒轉(zhuǎn)基因作物研究中的應(yīng)用

抗病品種的培育、推廣是控制作物病毒病最為經(jīng)濟(jì)有效的途徑。RNAi被認(rèn)為是一種古老的植物抗病毒機(jī)制［16－19］，是用來防止外來遺傳物質(zhì)干擾自身基因組功能和穩(wěn)定性的重要機(jī)制，是生物體中一種不完全的原始生物免疫系統(tǒng)。病毒侵染植物時(shí)，當(dāng)病毒核酸的復(fù)制數(shù)量達(dá)到強(qiáng)烈干擾植物基因組正常生理生化功能時(shí)，植物會(huì)通過甲基化修飾或激活特異性RNA降解系統(tǒng)來專一性降解病毒RNA，從而抑制病毒復(fù) 制［20］。自 從 1986 年 Powell－Abel等［21］首次獲得抗煙草花葉病毒（T MV）侵染的轉(zhuǎn)基因煙草以來，很多研究人員開始將病毒的不同基因（如復(fù)制酶基因、運(yùn)轉(zhuǎn)蛋白基因、外殼蛋白基因等）序列導(dǎo)入植物，強(qiáng)化植物體天然的抗病毒機(jī)制，均獲得抗病毒植株。

1999年P(guān)into等［22］將南方菜豆花葉病毒屬的水稻黃斑駁病毒（Rice yellow mottle virus，RYMV）復(fù)制所需酶的部分基因通過構(gòu)建載體而轉(zhuǎn)化水稻，誘發(fā)基因沉默，從而使植物具有RY MV的抗性，且這種抗性能穩(wěn)定遺傳3代。2000年 Wang等［23］利用大麥黃矮病毒（Barley yellow d war f vir us，BYDV）PAV的復(fù)制酶基因片斷的反向重復(fù)序列載體（hp BYDVpol）轉(zhuǎn)化大麥，獲得對(duì)PAV免疫的植株。2001年Tenllado等［24－25］分別以直接注射和農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化兩種方式將病毒復(fù)制酶基因部分序列構(gòu)建ds RNA導(dǎo)入植物葉片細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種方式都可成功阻止辣椒輕型斑駁病毒（Peppermild mottle virus，PMMo V）、煙草蝕斑病毒 （Tobacco etch vir us，TEV）和苜?；ㄈ~病毒（Alfalfa mosaicvirus，A MV）3種病毒的侵染過程。2002年Kalantids等［26］將黃瓜花葉病毒（Cucu mber mosaic virus，CMV）部分基因的c DNA反向重復(fù)序列導(dǎo)入煙草中，并且檢測(cè)到一個(gè)完全抗CMV的株系。2004年Ma等［27］根據(jù)抗水稻矮縮病毒（Ricedwar fvirus，RDV）序列，構(gòu)建了與其相關(guān)的RNA干擾序列，導(dǎo)入水稻中，發(fā)現(xiàn)對(duì)水稻矮縮病毒有很高的抗性。2005年Andika等［28］證實(shí)RNAi誘導(dǎo)的抗甜菜壞死黃脈病毒（Beet necrotic yellow vein virus，BNYVV）在葉中比根部有效。2006年Shuichiro Takahashi等［29］分別以馬鈴薯X病毒（Potato virus X，PVX）的外殼蛋白基因和編碼RNA沉默抑制因子的TGBp1基因?yàn)榘形稽c(diǎn)來設(shè)計(jì)si RNA，結(jié)果顯示這兩種si RNA都能干擾PVX的侵染。2007年代玉華等［30］對(duì)水稻條紋病毒（Rice stripe virus，RSV）的CP基因，設(shè)計(jì)了ds RNA，構(gòu)建干涉載體，遺傳轉(zhuǎn)化水稻，獲得了能穩(wěn)定遺傳、高抗或免疫的植株。2011年Taku mi等［31］將RSV編碼的7個(gè)基因都構(gòu)建成干涉載體，分別導(dǎo)入水稻受體，接種試驗(yàn)表明：轉(zhuǎn)CP、SP基因的水稻對(duì)接種免疫，轉(zhuǎn)p C1基因的水稻抗病性顯著提高，轉(zhuǎn)p C2和p C4基因的水稻抗病性沒有增加。

眾多成功的事例說明，利用RNAi技術(shù)以工程化的手段賦予植物體病毒抗性具有高度可行性，有可能成為植物抗病毒基因工程研究中的一種特異抗性手段［32］。20世紀(jì)80年代末，美國(guó) Monsanto、Cal gene、Du Pont等公司即開始進(jìn)行RNAi轉(zhuǎn)基因抗病毒作物的研究開發(fā)，并在90年代末獲批釋放了第1批轉(zhuǎn)基因作物，如轉(zhuǎn)病毒CP基因抗馬鈴薯卷葉病毒（Potato leaf roll virus，PLRV）、馬鈴薯 Y病毒（Potato virus Y，PVY）的馬鈴薯等［33］。

3 RNAi介導(dǎo)的抗病毒轉(zhuǎn)基因作物的安全性

3．1 食用安全性

3．1．1 過敏原

人們可能認(rèn)為基因改造食品潛在危險(xiǎn)來自于基因轉(zhuǎn)化過程本身，故認(rèn)為基因食品是有害的。然而，天然食品不等于安全食品，沒有零風(fēng)險(xiǎn)的食品，如小麥粉、谷子、花生、大豆、杏、板栗、腰果、魚、蝦、蟹、龍蝦、雞蛋、牛奶等對(duì)不同的人來說，都可能成為過敏原，一般的蔬果也可能含有致癌物，而特定的食品在經(jīng)過不同的搭配混合后，一樣會(huì)產(chǎn)生毒素。應(yīng)用RNAi策略對(duì)作物抗病毒特性的遺傳改造，導(dǎo)入的外源基因本身就是寄生于作物的病毒基因，且以雙鏈發(fā)夾結(jié)構(gòu)存在，通過特異性降解病毒基因而達(dá)到抗病毒的目的，在轉(zhuǎn)基因植株內(nèi)不會(huì)表達(dá)外源蛋白，對(duì)應(yīng)的抗病毒轉(zhuǎn)基因作物的營(yíng)養(yǎng)成分與原作物沒有差異，故轉(zhuǎn)基因植物不會(huì)增加過敏蛋白，不會(huì)引入新的過敏原。牛顏冰［34］對(duì)表達(dá) CMV2ΔRep或 To MV2 MP ds RNA的轉(zhuǎn)基因煙草植株進(jìn)行Northernblot分析已經(jīng)證明了這種結(jié)論。根據(jù)實(shí)質(zhì)等同原則如果一種新食品或食品成分與已存在的食品或食品成分實(shí)質(zhì)等同，能夠被認(rèn)為與傳統(tǒng)食品或食品成分一樣安全［35］。因此，通過該機(jī)制所產(chǎn)生的抗病毒轉(zhuǎn)基因植物可以符合人們對(duì)生物安全性的高要求。

3．1．2 殘留的ds RNA

RNAi轉(zhuǎn)基因作物通常通過dsRNA介導(dǎo)靶基因沉默，所以殘留dsRNA可能存在風(fēng)險(xiǎn)。目前，臨床研究表明口服ds RNA對(duì)哺乳動(dòng)物不會(huì)產(chǎn)生影響［36］。這是因?yàn)閐s RNA不會(huì)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞間傳遞或者是很快地被降解。因?yàn)椴溉閯?dòng)物細(xì)胞間信號(hào)傳遞機(jī)制要比植物、線蟲、昆蟲復(fù)雜得多，而且ds RNA通過人的胃和腸道時(shí)會(huì)被其中的酶和菌群降解。哺乳動(dòng)物中缺乏依賴于RNA的RNA聚合酶（Rd Rp），不存在放大級(jí)聯(lián)反應(yīng)。Irie［37］等人發(fā)現(xiàn)，在低等生物中RNAi可持續(xù)存在，但RNAi在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中只能維持一段時(shí)間。一般注入ds RNA后的2～3 d，RNAi的作用最明顯，而后1～2 d內(nèi)，靶mRNA的豐度就能恢復(fù)到注射RNAi之前的水平。

除了口服dsRNA不會(huì)對(duì)哺乳動(dòng)物產(chǎn)生影響外，Gil等［38］的研究表明，dsRNA大于30 bp在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中不會(huì)引起RNAi現(xiàn)象，因?yàn)檩^長(zhǎng)的ds RNA在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中能誘導(dǎo)干擾素生成，導(dǎo)致非特異性的蛋白質(zhì)合成障礙；另一方面，dsRNA又能誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生多種抗病毒蛋白的酶，發(fā)生非特異性的RNA降解效應(yīng)。而Sabine［39］研究表明引發(fā)有效RNAi的ds RNA最短不得短于21 nt，Dicer能與200～500 nt范圍內(nèi)的ds RNA結(jié)合，底物片段越短，Dicer酶的活性也就越弱。因此，如果既使ds RNA發(fā)揮作用又不使其對(duì)哺乳動(dòng)物造成危害，要控制好ds RNA的長(zhǎng)度。而目前在轉(zhuǎn)基因作物中應(yīng)用的ds RNA長(zhǎng)度一般大于30 bp。這些都表明攝食轉(zhuǎn)ds RNA的食物不會(huì)對(duì)哺乳動(dòng)物產(chǎn)生影響。

3．1．3 siRNA 水平

RNAi通過si RNA發(fā)揮作用。除了dsRNA策略的RNAi，在轉(zhuǎn)基因作物研究中有的直接導(dǎo)入si RNA。短于30 bp的si RNA，不會(huì)促發(fā)干擾素效應(yīng)，能特異性地降解mRNA，引起哺乳動(dòng)物細(xì)胞的基因沉默。近來在藥物研究領(lǐng)域發(fā)現(xiàn)，si RNA分子在哺乳動(dòng)物體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生脫靶效應(yīng)［40］，因此，對(duì)于siRNA在轉(zhuǎn)基因作物中的殘留是否對(duì)哺乳動(dòng)物產(chǎn)生影響是最值得關(guān)心的問題。

然而siRNA在環(huán)境中不穩(wěn)定，且RNAi機(jī)制本身就是植物自然存在的一種古老機(jī)制，多年來也未曾發(fā)現(xiàn)對(duì)哺乳動(dòng)物造成負(fù)面影響。siRNA的藥物研究表明，siRNA在體內(nèi)處于極不穩(wěn)定狀態(tài)。這主要是因?yàn)槠湎鄬?duì)分子質(zhì)量?。s為7 000），容易被腎透析并很快清除，也容易被內(nèi)源性的血漿RNA酶降解，在血漿內(nèi)半衰期為5～60 min［41］。

對(duì)于siRNA發(fā)揮沉默作用，其劑量問題是不容忽視的。唐省三等［42］在研究中發(fā)現(xiàn)si RNA對(duì)病毒性心肌炎療效的影響是劑量依賴性的，隨注射si RNA劑量增加，病理變化逐漸減輕。在轉(zhuǎn)基因食品烹飪和加工過程中si RNA易降解，在體內(nèi)易降解，因此殘留的si RNA劑量遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于藥物的劑量。因此，基于RNAi作用獲得的轉(zhuǎn)基因食品對(duì)哺乳動(dòng)物的影響應(yīng)該是微不足道的。但是為了進(jìn)一步確保安全，應(yīng)該對(duì)每一種RNAi轉(zhuǎn)基因作物產(chǎn)品進(jìn)行si RNA含量的測(cè)定。

3．2 環(huán)境安全性

抗病毒轉(zhuǎn)基因作物除了考慮到哺乳動(dòng)物（包括人）的安全性外，還要考慮到對(duì)其他非靶標(biāo)生物的影響，對(duì)生態(tài)環(huán)境的作用，及插入的外源基因是否會(huì)與病毒的核酸發(fā)生重組而產(chǎn)生新病毒等問題。

RNAi對(duì)靶基因的沉默是高度特異性的，一般來說，當(dāng)si RNA有4個(gè)或以上堿基不配對(duì)時(shí)，RISC將無法識(shí)別該mRNA，一個(gè)堿基的突變甚至也會(huì)對(duì)干擾的效果產(chǎn)生巨大的影響［43］。所以RNAi的轉(zhuǎn)基因作物對(duì)非靶標(biāo)生物的影響很?。?4］。到目前為止，在獲得釋放的美國(guó)3個(gè)轉(zhuǎn)CP基因作物南瓜、番木瓜和李中，并沒有發(fā)現(xiàn)任何的過敏原［45］。表達(dá)李痘皰病毒（Plumpox virus，PPV）CP基因的李樹與非轉(zhuǎn)基因的相比，節(jié)肢動(dòng)物及傳毒蚜蟲的種類和數(shù)量沒有差異［46］。對(duì)抗番木瓜環(huán)斑病毒（Papaya ringspot virus，PRSV）的番木瓜的研究表明，土壤各層的放線菌多樣性和總量沒有受到顯著影響［47］。雖然還沒有發(fā)現(xiàn)RNAi對(duì)非靶標(biāo)生物的影響，但基于非靶標(biāo)生物可能存在靶基因的同源序列，脫靶效應(yīng)將成為基于RNAi技術(shù)轉(zhuǎn)基因作物安全性評(píng)價(jià)的關(guān)鍵問題［48］。

3．2．1 RNAi介導(dǎo)的抗病毒作物不存在重組風(fēng)險(xiǎn)

在自然環(huán)境下，植物病毒間的重組已在苜蓿花葉病毒屬（Al famovirus）、雀麥花葉病毒屬（Bromovir us）和番茄叢矮病毒科（To mbusviridae）中發(fā)現(xiàn)［49］。某些野生的植物病毒通過重組從轉(zhuǎn)基因植物中截獲一定的病毒基因也已被證明。如Borja等［50］發(fā)現(xiàn)，番茄叢矮病毒（Tomato bushy stunt virus，TBSV）CP突變體和轉(zhuǎn)基因CP之間由于發(fā)生了重組而導(dǎo)致野生型病毒的再生。Falk等［49］認(rèn)為，轉(zhuǎn)基因植株中的RNA與野生病毒RNA基因組之間重組率很低，即便是發(fā)生了重組，新的重組病毒在整個(gè)病毒侵染周期的一系列過程中，也不會(huì)有更高的生活力［51］。然而采用RNAi介導(dǎo)的抗性策略能夠有效地避免重組發(fā)生。因?yàn)镽NAi介導(dǎo)的抗病毒轉(zhuǎn)基因作物主要是通過將病毒基因組上的基因構(gòu)建成ds RNA，將導(dǎo)入的基因與其同源的入侵RNA都降解成21～26 nt的干擾型 RNA（si RNA）［52］。通過這種方法所獲得的抗病毒植株在轉(zhuǎn)化的細(xì)胞質(zhì)中有少量或者沒有轉(zhuǎn)基因mRNA積累［53］，由于缺少重組所需的必要模板，所以不會(huì)發(fā)生重組。

3．2．2 脫靶效應(yīng)及對(duì)非靶標(biāo)生物的影響

脫靶效應(yīng)是指由siRNA引起的、通過RNAi機(jī)制作用于非靶mRNA導(dǎo)致非靶基因沉默的現(xiàn)象。當(dāng)siRNA分子的中間有一個(gè)堿基與mRNA不配對(duì)時(shí)，RISC仍具有識(shí)別該mRNA的能力。這使得si RNA能夠介導(dǎo)序列相似的非靶mRNA的降解從而導(dǎo)致非靶基因的沉默［43］。目前已知脫靶效應(yīng)在mRNA水平和蛋白質(zhì)表達(dá)水平上都能夠檢測(cè)出來［54］。

Fedorov等發(fā)現(xiàn)一段隨機(jī)選擇的siRNA可以通過完整的RNAi通路實(shí)現(xiàn)細(xì)胞存活率的改變，但這一毒性不依賴于靶基因的沉默，si RNA誘導(dǎo)的脫靶效應(yīng)產(chǎn)生了可觀測(cè)到的表型［55］。Xing等在擬南芥中同樣發(fā)現(xiàn)RNAi可以產(chǎn)生非預(yù)期的花粉活力下降的表型［56］。所以在開發(fā)RNAi轉(zhuǎn)基因作物時(shí)，最為關(guān)鍵的問題就是要進(jìn)行高效特異的si RNA序列設(shè)計(jì)和化學(xué)修飾，可以既保持或增強(qiáng)靶基因的特異性沉默效果，又避免si RNA誘導(dǎo)脫靶作用。傳統(tǒng)的BLAST來搜索脫靶基因會(huì)忽略很多候選的脫靶基因，而通過計(jì)算生物學(xué)方法能夠在精度和成本之間得到平衡，可以迅速找出候選的脫靶基因［57］。目前網(wǎng)上許多脫靶評(píng)估軟件，如ds Check不僅能對(duì)si RNA脫靶可能性進(jìn)行精確的軟件搜索驗(yàn)證，而且提供最小化脫靶效應(yīng)ds RNA的設(shè)計(jì)［58］。

3．2．3 siRNA殘留對(duì)非靶標(biāo)生物的影響

在考慮siRNA對(duì)非靶標(biāo)生物的影響時(shí)，必須要強(qiáng)調(diào)的是siRNA的劑量是否足以引起脫靶效應(yīng)。由于si RNA的目的基因的沉默效率和脫靶效應(yīng)幾率都與siRNA的濃度呈正相關(guān)，因此為了避免高劑量的siRNA引起的脫靶效應(yīng)，在轉(zhuǎn)基因育種中可以優(yōu)化si RNA池（siRNA pool），即通過同時(shí)嚴(yán)格設(shè)計(jì)幾條特異位點(diǎn)的siRNA，挑選最有效的siRNA最佳混合比例。這樣靶向同一mRNA的不同siRNA的單獨(dú)濃度降低了，降低了脫靶效應(yīng)幾率，而混合的siRNA的沉默效率卻是幾條siRNA的加和甚至更高，因此沉默效率不會(huì)下降，實(shí)現(xiàn)了目的基因沉默的效率最大化和最小的脫靶效應(yīng)發(fā)生的可能性。

4 討論和展望

從本質(zhì)上講，轉(zhuǎn)基因作物和常規(guī)遺傳育種育成的品種都是在原有品種的基礎(chǔ)上對(duì)部分性狀進(jìn)行修飾。傳統(tǒng)的育種方法是以基因突變和有性雜交為基礎(chǔ)，限于自然界中自發(fā)的基因重組和交換，而轉(zhuǎn)基因作物育種是人為地將某些生物的基因轉(zhuǎn)移到作物的遺傳物質(zhì)中去，使其在產(chǎn)量、抗性、營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)、消費(fèi)品質(zhì)等方面向人們所需要的方向轉(zhuǎn)變。基因重組技術(shù)縮短了新基因產(chǎn)生的時(shí)間，打破了生物種之間的基因交流界限。因此，人們擔(dān)心轉(zhuǎn)基因作物的應(yīng)用會(huì)產(chǎn)生一些食品和生態(tài)安全風(fēng)險(xiǎn)。但是，可能的風(fēng)險(xiǎn)不等于真實(shí)的風(fēng)險(xiǎn)。隨著轉(zhuǎn)基因作物的應(yīng)用，各國(guó)都將轉(zhuǎn)基因作物安全評(píng)估納入到轉(zhuǎn)基因作物的監(jiān)管中［59］，分為食品營(yíng)養(yǎng)安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和生態(tài)安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估過程是一個(gè)從建立問題也稱危害性識(shí)別，到最后給出風(fēng)險(xiǎn)結(jié)論的過程，由危害性識(shí)別、暴露評(píng)估、效果測(cè)試、風(fēng)險(xiǎn)描述等幾部分組成［60］。因?yàn)椴淮嬖诮^對(duì)的安全性和零風(fēng)險(xiǎn)，轉(zhuǎn)基因作物風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的第1步就是要求對(duì)轉(zhuǎn)基因作物的潛在危害做合理假定，在此過程中要毫不猶豫地忽略無關(guān)緊要的假定危害而保留重大的問題并做進(jìn)一步的細(xì)化考慮［61］。在轉(zhuǎn)基因作物的安全評(píng)價(jià)方面，國(guó)際上已經(jīng)廣泛接受和采用實(shí)質(zhì)等同原則和個(gè)案分析原則。

作為生物界普遍存在的機(jī)制之一，RNAi技術(shù)已在全球范圍迅速發(fā)展，其優(yōu)勢(shì)有目共睹。RNAi介導(dǎo)的抗病毒轉(zhuǎn)基因植株具有高效、特異性抗性，且不會(huì)翻譯成有功能的病毒蛋白質(zhì)，不存在病毒RNA重組、異源包裝及協(xié)生作用的潛在生物風(fēng)險(xiǎn)，具有較高的生物安全性。雖然RNAi介導(dǎo)的抗病毒轉(zhuǎn)基因作物也潛在一些風(fēng)險(xiǎn)，如對(duì)非靶標(biāo)生物的影響，但是隨著對(duì)RNAi機(jī)制的不斷深入了解，通過RNAi技術(shù)的日臻完善，及構(gòu)建嚴(yán)密的、科學(xué)的、合理的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估系統(tǒng)，對(duì)轉(zhuǎn)基因植物的商業(yè)化大面積釋放所存在的潛在生態(tài)學(xué)影響進(jìn)行長(zhǎng)期的監(jiān)測(cè)監(jiān)控研究，將為RNAi更加安全有效地應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因作物開辟更廣闊的前景。

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