東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院 劉延國 張 琳 馮香安 李 杰＊

由于抗生素存在藥物殘留和耐藥性的問題，給動物和消費者健康都帶來了危害。因而抗生素作為促生長飼料添加劑將會受到更嚴格的限制。在此情況下，無藥物殘留和抗藥性問題的益生菌添加劑將有廣闊的應(yīng)用前景。孔令勇和許國新（2003）在益生菌取代抗生素對肉雞生產(chǎn)性能的影響中結(jié)果顯示，使用益生菌的試驗組日增重較快、料肉比和死淘率較低。何明清和謝鏡懷（1986）試驗發(fā)現(xiàn)：在仔豬腹瀉發(fā)生初，空腸內(nèi)的大腸桿菌由原來的對數(shù)值5.0±1.5上升為 6.4±0.9（P＜0.01）；直腸內(nèi)由7.1±1.0上升為7.7±0.9（P＜0.05）。說明致病性大腸桿菌迅速繁殖導(dǎo)致腸內(nèi)細菌區(qū)系紊亂，宿主抵抗力下降發(fā)生腹瀉。所以抑制大腸桿菌等致病菌的繁殖和生長是動物預(yù)防疾病，提高生產(chǎn)性能的重點之一。郝生宏等（2008）在0～3周齡肉仔雞日糧中分別加入地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、乳鏈球菌和啤酒酵母，均都能顯著提高成活率，降低腹瀉率并改善盲腸菌群。許多研究發(fā)現(xiàn)，益生菌及其代謝產(chǎn)物可以抑制消化道內(nèi)致病菌的生長，降低仔豬腹瀉率，提高生產(chǎn)性能。能在腸道中定植是益生菌發(fā)生作用的前提，但在腸道內(nèi)能生存并穩(wěn)定下來的微生物，必須能耐受種種不利環(huán)境的考驗，包括胃酸、膽鹽、腸道蠕動、消化酶、免疫反應(yīng)、內(nèi)源的微生物以及生產(chǎn)的抗菌物質(zhì)等。所以益生菌的耐受性（耐酸、耐膽鹽能力等）也是衡量益生菌能否發(fā)揮益生作用的基本指標。

1 益生菌

益生菌是指對人、動物有益影響的那些活性微生物，在通過攝入一定的數(shù)量后，對宿主產(chǎn)生一種或多種特殊的能產(chǎn)生超越其固有的基本營養(yǎng)價值的保健作用。2002年歐洲權(quán)威機構(gòu)歐洲食品與飼料菌協(xié)會給出最新定義：益生菌是活的微生物，攝入充足的數(shù)量后，對宿主產(chǎn)生一種或多種特殊且經(jīng)論證確實存在的健康益處（裴志花，2010）。

美國 FDA及 AAFCO（1989）列出了 42種可以直接飼喂且認為是安全的微生物品種，但作為飼用微生物添加劑的主要有乳酸菌屬、糞鏈球菌、芽孢桿菌、仙人山屬菌等。中國農(nóng)業(yè)部1999年公布允許使用的飼料級微生物有12種。依照上述益生菌種的選擇標準，目前作為益生菌種應(yīng)用最多的為乳酸菌、雙歧桿菌和芽孢桿菌。在生產(chǎn)中應(yīng)用的益生菌制劑多為這些益生菌單一或多種菌株混合制劑。

2 益生菌的抑菌作用

2.1 通過生物奪氧方式阻止病原菌的繁殖 益生菌種的某些菌株，如需氧芽孢桿菌，以孢子狀態(tài)或其他活菌形式進入畜禽消化道后生長繁殖，消耗腸內(nèi)的氧氣，造成局部厭氧環(huán)境，利于專性厭氧菌（如乳桿菌、雙歧桿菌和腸球菌等）的定植和生長。使腸內(nèi)正常微生物之間恢復(fù)平衡狀態(tài)，抑制致病菌的生長。康白等（1992）給下痢仔豬連續(xù)3 d口服蠟樣芽抱桿菌后，腸內(nèi)需氧菌與厭氧菌之比由下痢時的1∶1恢復(fù)到健康時的1∶100，厭氧菌中雙歧桿菌和乳酸桿菌顯著增加，而大腸桿菌、沙門氏菌顯著減少。乳酸菌的異型發(fā)酵會生成二氧化碳，可以抑制霉菌和一些革蘭氏陰性菌。由于二氧化碳的蓄積，造成厭氧環(huán)境，抑制了需氧微生物的生長。研究表明，混合氣體中二氧化碳的濃度超過30%時，就可以抑制細菌生長。

2.2 通過黏附機制和競爭排斥作用阻止病原菌的繁殖 黏附是致病菌定植于腸道的前提條件，對致病菌黏附的抑制可干擾其對細胞的侵襲。李樹鵬和趙獻軍（2004）指出，許多益生菌可以通過與致病菌競爭腸上皮微絨毛上的脂質(zhì)和蛋白質(zhì)上的相同復(fù)合糖受體來達到阻止致病菌的定植。雙歧桿菌通過脂壁磷酸黏附于腸上皮細胞，構(gòu)成一層菌膜屏障，并產(chǎn)生細胞外糖苷酶，降解上皮細胞上作為潛在致病菌及其定植，形成腸道化學(xué)保護屏障，可保護腸道內(nèi)的微環(huán)境，阻止致病菌的侵入、黏附和定植。而營養(yǎng)的競爭發(fā)生在小腸上皮細胞，主要是由于益生菌能夠搶先吸收利用小腸上皮細胞內(nèi)的營養(yǎng)物質(zhì)進行生存和繁殖，抑制有害菌在消化道的增殖。有研究者用嗜酸乳桿菌與腸致病菌一起同Caco-2細胞系（具有人小腸微絨毛細胞的某些特性）培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)腸致病菌的黏附能力受抑制。傅曉麗等（1999）的研究表明，嗜酸乳桿菌對侵襲性大腸埃希菌、產(chǎn)毒性大腸埃希菌和痢疾志賀菌均具有明顯的黏附拮頏作用。Fujiwara等（2001）研究發(fā)現(xiàn)，長雙歧桿菌Bifidobacterium longum SBT 2928可以分泌一種被稱為黏附抑制因子的蛋白質(zhì)，這種蛋白分子可以有效地抑制腸毒性大腸桿菌Pb176對糖脂受體GA1的黏附以及對腸上皮樣細胞HCT-8的黏附。嗜酸乳桿菌可顯著降低用大腸桿菌、沙門氏菌和葡萄球菌接種過的仔雞的死亡率，并能抑制這些病原菌在腸道內(nèi)定植。Muralidhara等（1997）給剛出生的仔豬飼喂乳酸桿菌，試驗結(jié)果表明，糞便中乳酸桿菌與大腸桿菌的比例達到1280∶1，而對照組的比例為2∶1，高比例的乳酸桿菌可以保護動物抵抗腸致病性大腸桿菌的侵襲，預(yù)防腹瀉。王斌等（2006）研究表明，路氏乳桿菌JCM1081可以抑制致病性大腸桿菌對腸上皮樣細胞HT-29的黏附（28%）和侵襲（27.7%），并可減弱致病性大腸桿菌對細胞的損傷。

像致病菌一樣，益生菌在腸道的黏附也是定植的先決條件。許多研究結(jié)果表明，菌體黏附能力的大小與其凝集能力和菌體表面疏水特性呈正相關(guān)關(guān)系。研究證實，乳酸菌的凝集可以形成阻止致病菌定植和感染的屏障。劉勇等（2010）對4株益生菌的表面特性的研究中發(fā)現(xiàn)，益生菌對致病菌有凝集能力，對致病菌凝集率隨益生菌、致病菌和培養(yǎng)時間的變化而不同。具有較高自凝集能力的菌株，其疏水能力及對致病菌的凝集能力也較高。

2.3 通過發(fā)酵產(chǎn)生代謝產(chǎn)物和生理活性物質(zhì)抑制病原菌 益生菌除了自身可以抑菌以外，其代謝產(chǎn)物也有很強的抑菌作用。某些乳酸桿菌和鏈球菌可產(chǎn)生細菌素、過氧化氫、二氧化碳、有機酸等，它們在體外具有抑制沙門氏菌、假單胞菌、葡萄球菌、變形菌等細菌生長的作用。單春喬等（2009）研究發(fā)現(xiàn)，嗜酸乳桿菌SR-1代謝產(chǎn)物對15種常見的抗生素有耐藥性；pH值為3.0時，其有廣譜的抗菌活性，對35種常見革蘭氏陽性和革蘭氏陰性致病菌均有明顯的抑制作用，但對腸道內(nèi)益生菌無抑制作用；在與致病菌混合培養(yǎng)40 h內(nèi)可以徹底清除金黃色葡萄球菌，48 h內(nèi)可以完全消滅大腸桿菌。

2.3.1 產(chǎn)酸 乳酸菌產(chǎn)生的乳酸、乙酸等酸性產(chǎn)物可抑制病原菌生長繁殖。Jin等（1996）研究發(fā)現(xiàn)乳桿菌對大腸桿菌有抑制作用，代謝產(chǎn)物pH調(diào)至6.5時，則不再產(chǎn)生抑菌圈，并此推斷其抑菌物質(zhì)主要為乳酸。趙佳銳等（2006）在腸道益生菌體外抑菌試驗中證實了細菌發(fā)酵濃縮液中乙酸和乳酸在低pH條件下的抑菌作用。王凱等（2008）選擇72頭斷奶仔豬研究了飼喂乳酸菌制劑對斷奶仔豬腸道生理生化指標的影響。研究結(jié)果表明，以1.5%乳酸菌制劑拌料發(fā)酵6 h后飼喂仔豬，盲腸、結(jié)腸和直腸后段內(nèi)容物pH分別顯著下降0.77、0.79和0.26，后腸段和糞中大腸桿菌數(shù)和總細菌數(shù)均無顯著差異，但盲腸乳酸桿菌數(shù)有顯著提高。

2.3.2 產(chǎn)生細菌素 乳酸菌能產(chǎn)生類細菌素物質(zhì)，對病原菌有抑制作用。王柏琴等（1996）報道乳酸乳球菌產(chǎn)生的Nisin細菌素可以抑制鏈球菌、葡萄球菌和梭狀芽孢桿菌的生長。乳酸菌能產(chǎn)生細菌素，對革蘭陽性細菌產(chǎn)生抑制或殺死作用（Ward 等，1990）。Dunne等（1999）發(fā)現(xiàn)，唾液乳桿菌的抗菌產(chǎn)物ABP 118（一種細菌素）對一系列潛在病原菌均有較廣譜的抑菌性。陳紅梅等（2008）研究表明，從整個仔豬階段（14～70日齡）綜合各方面的效果來看，哺乳仔豬飼糧中添加10%乳酸菌素、斷奶仔豬飼糧中添加0.4%乳酸菌素均可極顯著提高日增重、粗纖維的表觀消化率；明顯降低糞中大腸桿菌數(shù)量，從而減少了仔豬腹瀉的發(fā)生。吳榮榮等（2009）證明，菌株嗜酸乳桿菌A、戊糖片球菌M和戊糖片球菌T所產(chǎn)的細菌素對多種革蘭氏陽性、陰性細菌有顯著的抑制作用，對部分真菌也有不同程度的抑菌效果，抑菌譜較寬。羅璠（2010）在動物乳桿菌發(fā)酵液的體外抑菌試驗中也發(fā)現(xiàn)，除酸后的發(fā)酵液對大腸桿菌、沙門氏桿菌、金黃葡萄球菌等有明顯的抑制作用。不同的試驗結(jié)果都顯示了細菌素對致病菌的繁殖有明顯的抑制作用。

除此之外還能產(chǎn)生過氧化物（H2O2）、酶類、雙乙酰。嗜酸乳桿菌和保加利亞乳桿菌可以產(chǎn)生H2O2，抑制葡萄球菌等病原菌的生長繁殖。激活動物大腸內(nèi)的過氧化氫酶-硫氰酸鹽反應(yīng)系統(tǒng)，使乳酸過氧化物酶與H2O2結(jié)合，然后將硫氰酸鹽氧化成氧化性中間產(chǎn)物，抑制葡萄球菌等病原菌的生長繁殖（閔曉梅等，2001）。研究發(fā)現(xiàn)，雙歧桿菌和乳酸桿菌產(chǎn)生的胞外糖苷酶，還可降解腸黏膜上皮細胞的復(fù)雜多糖，而這些多糖是致病菌和細菌毒素的潛在受體，因此可以阻止毒素在上皮細胞的粘附和侵入。保加利亞乳酸桿菌的代謝產(chǎn)物能夠中和大腸桿菌外毒素，許多好氧菌產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物可幫助動物消除氧自由基。飼喂啤酒酵母后，腸道內(nèi)有益菌群大量增殖，它們不僅抑制潛在病原菌，也能阻止腸內(nèi)胺和氨產(chǎn)生、促進腸蠕動、維持完整的腸粘膜結(jié)構(gòu)。乳酸菌的各個屬在糖代謝同時都可產(chǎn)生雙乙酰，這種化合物對許多病原菌都有抑制作用。

2.4 幫助建立和維持正常的腸道優(yōu)勢菌群 在動物體消化道內(nèi)，當(dāng)有益菌處于優(yōu)勢菌群狀態(tài)時，機體才能維持健康。給成年動物或其體內(nèi)的非有益菌區(qū)系補充雙歧桿菌、乳酸菌等益生菌有利于優(yōu)勢菌群的建立，維持正常微生態(tài)系統(tǒng)的平衡。孟祥晨和霍貴成（2004）在雙歧桿菌對正常小白鼠腸道菌群的影響研究結(jié)果顯示，試驗組與對照組相比，雙歧桿菌數(shù)量顯著增加，腸桿菌數(shù)量顯著下降，而乳桿菌有輕微增長，但差異不顯著。張常明等（2006）研究了在基礎(chǔ)日糧中添加植物源乳酸菌制劑對二元雜閹公豬腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果顯示，添加組消化道各段內(nèi)容物pH都有所降低，乳酸菌數(shù)量不同程度地高于對照組，且在胃底、十二指腸、空腸等部位都達到了顯著水平，盲腸和結(jié)腸內(nèi)容物中大腸桿菌的數(shù)量也有顯著降低。不同試驗表明，益生菌能抑制致病菌繁殖，改善胃腸道內(nèi)微生態(tài)平衡。

3 消化道環(huán)境對益生菌的影響

動物胃腸道的胃酸、膽鹽和多種消化酶類對益生菌都有潛在的滅活作用，抵御這些環(huán)境因素并保證足夠的活菌數(shù)量是益生菌定植于動物腸道并發(fā)揮益生作用的前提。成年豬正常胃液的pH為2.0～3.5，初生仔豬的胃中pH為2.l，前3周齡哺乳仔豬胃中pH分別為3.7、3.9、3.4，補料后pH上升至4.9，以后逐步下降，60日齡后可逐步達到正常水平，正常情況下胃排空時間為4 h，pH隨飲食結(jié)構(gòu)變化，但基本上pH約為3.0。這個酸度對于許多乳酸菌來說是不耐受的，攝入的乳酸菌必須經(jīng)過這個酸性環(huán)境，只有保證乳酸菌數(shù)量才能發(fā)揮益生作用。十二指腸中的膽鹽能抑制其中的細菌繁殖，對哺乳仔豬而言，膽囊內(nèi)膽汁量很少，在出生后3周內(nèi)膽汁量緩慢增加，一般在0.03% ～0.3%（紀振杰，2008）。 膽鹽具有很強的抗菌作用，對益生菌的抑制能力比酸性環(huán)境更強。這些因素都對益生菌的定植、繁殖有很大的影響。

飼用益生菌進入消化道后對其耐受力低，難以有足夠的活菌數(shù)量到達腸道或定植腸道而發(fā)揮作用（郝生宏等，2005）。林朝洪（2007）在對從消化道分離出的75株乳酸桿菌進行耐酸試驗發(fā)現(xiàn)：從消化道前段分離的菌株對酸的耐受性比從消化道后段分離出的菌株好。從胃分離的7個菌株對酸有較強的耐受性，其中4株的存活率達80%以上，另3株甚至超過90%。從直腸分離出的菌株耐酸性最差。辛羚等（2005）證明乳酸桿菌在pH值為2.5～4.5的人工胃液中具有較強的生存能力，2.5 h活菌數(shù)仍達108CFU/mL左右；在人工腸液和0.3%膽鹽中仍能存活。陳欣等（2006）研究證明：芽孢桿菌對人工胃液的耐受性很強，菌數(shù)基本無差異；乳酸桿菌和乳酸鏈球菌在70%膽鹽下8 h能存活。張璐（2008）試驗顯示枯草芽孢桿菌對低pH和高膽鹽的耐受能力很強，相比之下蠟狀芽孢桿菌的耐受性較低，在pH為2時存活率為46.2%，地衣芽孢桿菌在0.3%禽膽鹽下存活率為37.7%。許多試驗結(jié)果顯示消化道環(huán)境對益生菌的定植、繁殖有很大影響，不同的菌種對低pH和高膽鹽的耐受能力不同。如何提高益生菌的耐受性或者篩選出耐受性高的菌種在益生菌的生產(chǎn)應(yīng)用中有重大的意義。

4 小結(jié)

綜上所述，益生菌作為抗生素的替代物，不僅對大腸桿菌、沙門氏桿菌、葡萄球菌有很好的抑制作用，同時分泌消化酶促進代謝，幫助建立良好的胃腸道微生物環(huán)境等作用；一些益生菌對胃腸道環(huán)境也有一定的抵抗能力，為其在腸道定植發(fā)揮益生作用提供了保證。但是對于消化道內(nèi)土著微生物對益生菌的影響及益生菌在食糜中發(fā)揮抑菌作用的能力研究較少，多數(shù)益生菌在消化道中的耐受力不高也是制約益生菌廣泛應(yīng)用的問題之一，如何解決以上問題將會是未來研究的重點。

[1]陳紅梅，趙恒壽，韓彥珍，等.乳酸菌素對仔豬生產(chǎn)性能、飼料養(yǎng)分表觀消化率及糞大腸桿菌數(shù)量的影響[J].養(yǎng)豬，2006，4：3～5.

[2]陳欣,潘素華,胡黎黎，等.人源乳酸桿菌耐酸耐膽鹽能力的測定和鑒定[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2006，33（3）：278 ～ 279.

[3]單春喬，吳磊，劉秋晨，等.嗜酸乳桿菌SR-1發(fā)酵代謝產(chǎn)物的體外抑菌試驗分析[J].獸醫(yī)科技，2009，3：76 ～ 78.

[4]傅曉麗，徐建國，高守一.嗜酸乳桿菌對致瀉性大腸埃希氏菌上皮細胞粘附和侵襲的抑制作用[J].中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志，1999，19（2）：97～101.

[5]郝生宏，佟建明，薩仁娜，等.四株耐制粒益生菌對0～3周齡肉仔雞死亡率、腹瀉率及盲腸菌群的影響[J].中國飼料，2008，3：30～32.

[6]郝生宏，楊榮芳，佟建明，等.飼用益生菌在研究和應(yīng)用中存在的問題[J].中國飼料，2005，12：17 ～ 18.

[7]何明清，謝鏡懷.病、健仔豬不同腸段菌群的研究[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報，1986，12（4）：276 ～ 283.

[8]紀振杰.高抗逆性雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌的篩選及應(yīng)用研究[D].哈爾濱：黑龍江農(nóng)墾大學(xué)，2008.

[9]孔令勇，許國新.益生菌取代抗生素對肉雞生產(chǎn)性能的影響[J].中國飼料，2003，3：23 ～ 24.

[10]康白，何明清，集寧，等.蠟樣芽孢桿菌對羔羊、仔豬和雞腹瀉控制的流行病學(xué)分析[J].中國微生態(tài)學(xué)雜志，1992，4（4）：40 ～ 48.

[11]李樹鵬，趙獻軍.益生素與機體免疫作用研究進展 [J].家畜生態(tài)，2004，25（4）：134 ～ 138.

[12]林朝洪.豬源益生乳桿菌的分離、鑒定和篩選及E租C-PCR分型研究[D].雅安：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007.

[13]劉勇，張勇，包艷，等.4株益生菌的表面特性及抑制致病菌作用研究[J].中國食品學(xué)報，2010，10（2）：28 ～ 32.

[14]羅璠.動物乳桿菌發(fā)酵液的體外抑菌試驗[J].四川畜牧獸醫(yī)，2010，6：26～27.

[15]孟祥晨，霍貴成.雙歧桿菌對正常小白鼠免疫調(diào)節(jié)及腸道菌群的影響[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2004，35（4）：458 ～ 464.

[16]閔曉梅，孟慶翔.動物胃腸道正常微生物與活菌制劑在豬生產(chǎn)中的應(yīng)用[J].養(yǎng)豬，2001，1：9 ～ 12.

[17]裴志花，王開，馬紅霞.益生菌及其在養(yǎng)禽業(yè)中的應(yīng)用[J].中國畜牧獸醫(yī)，2010，37（5）：30 ～ 32.

[18]王斌，但國蓉，袁靜，等.乳桿菌黏附抑制致病性大腸桿菌對腸上皮樣細胞侵襲的初步研究[J].解放軍醫(yī)學(xué)雜志，2006，6：550～552.

[19]王凱，馬金磊，賴婷，等.乳酸菌劑對斷奶仔豬腸道生理指標的影響[J].中國獸醫(yī)雜志，2008，44（9）：21 ～ 23.

[20]王柏琴，楊潔彬，劉克.紅曲色素、乳酸鏈球菌素、山梨酸鉀對乳酸菌株的影響[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，1996，2：5 ～ 8.

[21]吳榮榮，張良，王倩.產(chǎn)細菌素乳酸菌的選育及其抑菌特性的研究[J].中國釀造，2009，6：20 ～ 22.

[22]辛羚，郭本恒，吳正鈞.3株乳桿菌在模擬消化環(huán)境中存活性能的研究[J].中國乳品工業(yè)，2005，33（5）：15 ～ 17.

[23]張常明，李路勝，王修啟，等.乳酸菌對斷奶仔豬生產(chǎn)性能及免疫力的影響[J].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2006，27（3）：81 ～ 84.

[24]張璐.飼用芽孢桿菌產(chǎn)品益生特性的體外評價研究[D].北京：北京畜牧獸醫(yī)研究所，2008.

[25]趙佳銳，范小兵，杭曉敏，等.腸道益生菌體外抑菌活性的研究[J].中國微生態(tài)學(xué)雜志，2006，18（2）：88 ～ 90.

[26]Dunne C，O’Halloran S，O’Mahony L，et al.In vivo and in vitro adhesion to epithelium of probiotic microorganisms[J].Gastroenterology，1999，116：4（2）：G3058.

[27]Fujiwara S，Hashiba H，Hirota T，et al.Inhibition of the binding of enterotoxigenic Escherichia coli Pb176 to human intestinal epithelial cell line HCT-8 by an extracelluar protein fraction cotaining BIF of Bifidobacterium longum SBT2928：suggestive evidence of blocking of the binding receptor gangliotetraosylceramide on the cell surface·Int[J].Food Microbiol，2001，67（1～ 2）：97.

[28]Jin L Z，Marquardt R R，Baidoo S K.Inhibition of enterotoxig-nic Eseheriehia coli K88，K99 and 987P by the Lacrobacillusi-solates from Porcine intestine[J].Journal of the Science of Food and Agrieulture，2000，80：619 ～624.

[29]Muralidhara K S.Effect of feeding lactobacilli on the coliform and Lactobacillus flora of the intestinal tissue and reces from pigs[J].Food Prot，1997，40：288～295.

[30]Ward D M，Weller R，Batesonmm.16S rRNA sequences reveal numerous uncultured microorganismsin anaturalcommunity[J].Nature，1990，345（6270）：63 ～ 65.