周會(huì)芳，王 麗，張艷軍，邊育紅

(天津中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，天津市現(xiàn)代中藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，天津市中藥化學(xué)及分析重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300193)

毒理學(xué)是研究外源化合物對(duì)生物體損害作用的一門(mén)學(xué)科，隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，新化學(xué)物質(zhì)日益增多，傳統(tǒng)的毒理學(xué)評(píng)價(jià)方法存在成本高，周期長(zhǎng)，敏感度低等諸多不足。胚胎干細(xì)胞最早是由1981年Evans和Martin分別從小鼠早期胚胎中分離培養(yǎng)成功并建立細(xì)胞系，1998年美國(guó)威斯康星大學(xué)的Thomson和約翰斯霍普金斯醫(yī)學(xué)中心的Gearhart成功的分離培養(yǎng)出人胚胎干細(xì)胞(human Embryonic Stem Cell，hESC)并在體外成功建系，使得胚胎干細(xì)胞再次成為研究的熱點(diǎn)。

代謝組學(xué)是20世紀(jì)90年代后期發(fā)展起來(lái)的一門(mén)新興學(xué)科，它是繼基因組學(xué)，轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)之后系統(tǒng)生物學(xué)的重要組成部分，它是英國(guó)Nicholson教授及其同事于1999年正式提出的［1］，代謝組學(xué)通過(guò)考察生物體由病理生理刺激或遺傳修飾引起的內(nèi)源性代謝產(chǎn)物的變化，研究機(jī)體整體的生物學(xué)狀況，它把人體作為一個(gè)完整的系統(tǒng)進(jìn)行研究，重點(diǎn)考察人體等生物系統(tǒng)的內(nèi)源性代謝物及其網(wǎng)絡(luò)在疾病和毒物，藥物作用下的變化規(guī)律，目前，代謝組學(xué)也是毒理學(xué)研究中的一種重要技術(shù)手段和有利工具，是當(dāng)前毒理學(xué)研究領(lǐng)域中最活躍的研究熱點(diǎn)［2］。本文主要就胚胎干細(xì)胞和代謝組學(xué)相關(guān)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)及基于胚胎干細(xì)胞的代謝組學(xué)在毒理學(xué)中的應(yīng)用現(xiàn)狀進(jìn)行了綜述，并對(duì)其中存在的問(wèn)題及發(fā)展趨勢(shì)進(jìn)行了初步探討。

1 胚胎干細(xì)胞在毒性評(píng)價(jià)中的應(yīng)用

1.1胚胎干細(xì)胞在毒性評(píng)價(jià)中的意義胚胎干細(xì)胞是一種存在于早期胚胎中的具有全能性細(xì)胞，可分化成三個(gè)胚層的細(xì)胞。由于它具有全能性，具有對(duì)藥物作用反應(yīng)迅速、敏感性高、干擾因素少等優(yōu)點(diǎn)，根據(jù)胚胎干細(xì)胞特性而發(fā)展起來(lái)的胚胎干細(xì)胞試驗(yàn)(embryonic stem test，EST)可以從細(xì)胞毒性，分化抑制以及分子生物學(xué)水平反映發(fā)育毒性，因此胚胎干細(xì)胞可以作為一種重要的體外藥物毒性評(píng)價(jià)工具［3］。

隨著工業(yè)生產(chǎn)的發(fā)展，人工合成化學(xué)物質(zhì)的種類(lèi)不斷增加，每年至少還有1000多種新的化學(xué)物質(zhì)進(jìn)入人類(lèi)的生產(chǎn)和生活環(huán)境，對(duì)外源性化合物的危險(xiǎn)性評(píng)價(jià)日益受到重視，目前急需能夠確切反映外源性化合物對(duì)人體毒性作用的安全性評(píng)價(jià)模型。hESC來(lái)源于人類(lèi)，能夠真實(shí)反映人類(lèi)細(xì)胞的生物特性，通過(guò)單一胚胎干細(xì)胞無(wú)限增殖和定向分化可以達(dá)到樣本的高度標(biāo)準(zhǔn)化，并且通過(guò)建立不同種族或地區(qū)的人類(lèi)胚胎干細(xì)胞載體能反映種族或地區(qū)間的生物特征差異。因此，應(yīng)用hESC進(jìn)行毒理學(xué)研究可以獲得更直接的外源性化合物人體毒理學(xué)研究的資料［2］。

藥物研發(fā)不僅周期長(zhǎng)，投入大，而且風(fēng)險(xiǎn)高，一個(gè)新藥從研發(fā)到上市大概需要?dú)v時(shí)10～15年，耗資近10億美元。傳統(tǒng)的藥物安全性評(píng)價(jià)的方法是給予一定數(shù)量實(shí)驗(yàn)動(dòng)物大劑量待測(cè)化合物，觀察其毒性效應(yīng)，然后將實(shí)驗(yàn)結(jié)果外推到暴露于小劑量相同化學(xué)物的大量人群，這種方法不僅試驗(yàn)周期長(zhǎng)，而且從動(dòng)物得到的數(shù)據(jù)很難外推到人。hESC作為一種體外毒性評(píng)價(jià)工具，具有快速、敏感、特異高、條件易控等優(yōu)點(diǎn)，可以避免使用大批動(dòng)物進(jìn)行的長(zhǎng)時(shí)間毒理研究，不僅可以節(jié)省動(dòng)物及人力投入，還可縮短實(shí)驗(yàn)周期，增加實(shí)驗(yàn)的敏感性。于傳統(tǒng)方法相比，不用考慮對(duì)人體及動(dòng)物的副作用，更無(wú)需大量懷孕動(dòng)物，一旦建系就可以獲得源源不斷的細(xì)胞用于研究，同時(shí)對(duì)細(xì)胞毒性而言，胚胎干細(xì)胞對(duì)藥物等化合物的敏感性高于成體組織［4］。而且hESC作為良好的轉(zhuǎn)染載體，能表達(dá)多種報(bào)告基因，能夠滿足研發(fā)早期高通量篩選的需求。

1.2胚胎干細(xì)胞在毒性評(píng)價(jià)中的應(yīng)用將hESC應(yīng)用于毒理學(xué)研究既可克服傳統(tǒng)的體內(nèi)和體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)的不足，又可避免種屬差異目前，hES已逐漸成為毒性篩選和毒理學(xué)機(jī)制研究必不可少的工具，其研究熱點(diǎn)主要集中于尋找特異的檢測(cè)終點(diǎn)和毒性效應(yīng)標(biāo)志物，進(jìn)而建立和完善體外毒性評(píng)價(jià)模型。

1.2.1 發(fā)育毒物的體外篩選動(dòng)物實(shí)驗(yàn)未發(fā)現(xiàn)沙利度胺明顯的毒副作用，但1954年沙利度胺的上市，卻在歐洲誕生了大量肢體缺陷的新生兒，這不僅揭示了動(dòng)物和人對(duì)藥物反映的差異，也揭示了藥物體內(nèi)篩選的局限性。EST是檢測(cè)不同受試物對(duì)細(xì)胞增殖和分化的影響，通過(guò)受試物對(duì)hESC細(xì)胞的影響，對(duì)受試物影響個(gè)體發(fā)育的毒性和致畸能力進(jìn)行判斷［5］，不需要受孕動(dòng)物，同時(shí)根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡男枰?，?xì)胞分化為特定的組織細(xì)胞，通過(guò)對(duì)受試物的胚胎毒性進(jìn)行高通量檢測(cè)［6］，已成為哺乳動(dòng)物發(fā)育毒性體外評(píng)價(jià)的代替方法。歐洲替代方法驗(yàn)證中心(the European Center for the Validation of Alternative Methods，ECVAM)曾在大約360種受試物中，選出有明確胚胎毒性的受試物30種，使用EST進(jìn)行胚胎發(fā)育毒性檢測(cè)，結(jié)果表明，與在體實(shí)驗(yàn)結(jié)論的符合率達(dá)到82%，其中強(qiáng)胚胎毒性的符合率更達(dá)到100%［7］。展示了EST成為受試物胚胎毒性初篩方法的良好基礎(chǔ)和應(yīng)用前景。

1.2.2 靶器官毒性研究由于有些受試物胚胎毒性的產(chǎn)生，可能表現(xiàn)為較強(qiáng)的靶器官特異性，根據(jù)ESC的多能性，可以在不同的誘導(dǎo)條件下將其向特定組織器官的特定細(xì)胞分化，而且這種分化過(guò)程能反映受試物在整個(gè)細(xì)胞發(fā)育全過(guò)程的影響，利用這一特點(diǎn)可以對(duì)受試物可能作用的靶器官細(xì)胞及其方式和階段進(jìn)行初步判別［3］。

Nieden等［8］結(jié)合當(dāng)前分子研究技術(shù)，發(fā)展了分子水平的EST，將受試物作用于分化的ESC，提取發(fā)育過(guò)程中第9天的的細(xì)胞RNA，進(jìn)行RT-PCR分析，然后進(jìn)行TaqMan PCR實(shí)時(shí)分析，研究肌球蛋白重鏈基因(Myosin Heavy Chain，MHC)的定量表達(dá)，MHC的調(diào)節(jié)性表達(dá)可能作為一種新的快速反應(yīng)胚胎毒性的檢測(cè)終點(diǎn)。

2 代謝組學(xué)在毒性評(píng)價(jià)中的應(yīng)用

代謝組學(xué)是20世紀(jì)90年代后期發(fā)展起來(lái)的一門(mén)新興學(xué)科，它是繼基因組學(xué)，轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)之后系統(tǒng)生物學(xué)的重要組成部分，它通過(guò)考察生物體由病理生理刺激和遺傳修飾引起的內(nèi)源性代謝產(chǎn)物的變化，研究機(jī)體整體的生物學(xué)狀況。代謝組學(xué)在毒理評(píng)價(jià)中的應(yīng)用主要是利用各種分析手段(高效液相色譜，High performance liquid chromatography ，HPLC、核磁共振，Nuclear Magnetic Resonance，NMR 和質(zhì)譜，Mass Spectrum，MS等)定量檢測(cè)生物樣本(尿液，血漿，組織提取液等)中的內(nèi)源性代謝產(chǎn)物，結(jié)合模式識(shí)別等化學(xué)技術(shù)對(duì)生物樣本進(jìn)行系統(tǒng)的測(cè)定和分析，比較生物體在不同狀態(tài)下的代謝指紋圖譜的差異，然后將這些代謝信息與生物體的病理生理變化聯(lián)系起來(lái)，確定導(dǎo)致這些代謝改變的靶器官和作用位點(diǎn)，獲得相關(guān)的生物標(biāo)志物。

2.1 毒性作用機(jī)制的研究藥物毒性作用機(jī)制是指機(jī)體接觸藥物開(kāi)始至出現(xiàn)毒性損傷之間的一系列分子機(jī)制，例如毒物如何進(jìn)入機(jī)體，如何與靶分子發(fā)生作用，如何產(chǎn)生其有害結(jié)果及機(jī)體的反應(yīng)等，通過(guò)代謝圖譜可對(duì)藥物破壞正常細(xì)胞后引起的內(nèi)源性代謝物的水平進(jìn)行分析，從而研究其毒性作用機(jī)制，為準(zhǔn)確評(píng)價(jià)藥物毒性提供理論依據(jù)［9］。

2.2 藥物臨床前毒性評(píng)價(jià)藥物臨床前安全性評(píng)價(jià)的目的之一就是確定藥物的毒性劑量范圍，并作為藥物的重要安全性能指標(biāo)，與傳統(tǒng)方法相比，利用代謝組學(xué)技術(shù)確定藥物毒性劑量范圍的準(zhǔn)確率更高，并為臨床合理用藥提供理論依據(jù)。

Chen等［10］利用液 -質(zhì)聯(lián)用(Liquid Chromatography-Mass Spectrometry，LC-MS)結(jié)合氣-質(zhì)聯(lián)用(Gas Chromatography-Mass Spectrometry，GC-MS)的方法對(duì)雷公藤多糖成分在大鼠體內(nèi)的毒性進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)給藥劑量達(dá)到100 mg·kg-1時(shí)發(fā)現(xiàn)氨基酸及膽堿水平升高等情況，而且波動(dòng)并不明顯，提示該藥可能具有較高的安全劑量，很大程度上提高了該藥的臨床應(yīng)用。Schoonen等［11］利用代謝組學(xué)的方法研究了對(duì)乙酰氨基酚在大鼠體內(nèi)的毒性，對(duì)多個(gè)劑量的代謝物水平波動(dòng)情況進(jìn)行檢測(cè)，至450 mg·kg-1時(shí)發(fā)現(xiàn)代謝物水平異常，由AST試劑盒證實(shí)該劑量下大鼠肝細(xì)胞出現(xiàn)壞死，故可將450 mg·kg-1定為藥物毒性劑量，從而為臨床安全用藥提供依據(jù)。

因此，代謝組學(xué)作為一種實(shí)驗(yàn)操作和數(shù)據(jù)處理相結(jié)合的技術(shù)，能在靈敏度和特異性上滿足藥物臨床前安全性評(píng)價(jià)的要求，而且在時(shí)間和效益上滿足創(chuàng)新藥物研發(fā)的需求。

2.3 確定毒物作用靶器官及特異性生物標(biāo)志物生物標(biāo)志物是指反映生物體系與環(huán)境因子的相互作用，并能客觀測(cè)定和評(píng)價(jià)的某種特征性指標(biāo)，可應(yīng)用于疾病的診斷、防治和藥物毒性的評(píng)價(jià)等。利用代謝組學(xué)研究代謝指紋圖譜，可發(fā)現(xiàn)藥物引起的內(nèi)源性代謝物的變化，找到與藥物毒 性相關(guān)的生物標(biāo)志物，并作為藥物毒性篩選的依據(jù)。

Boudonck等［12］應(yīng)用代謝組學(xué)尋找大鼠體內(nèi)腎毒性的早期生物標(biāo)志物。大鼠給予已知腎毒性藥物慶大霉素、順鉑和妥布霉素后，分別于1 d、5 d和28 d收集尿液和腎臟切片，通過(guò)氣-質(zhì)聯(lián)用(GC-MS)和液質(zhì)聯(lián)用(LC-MS)，發(fā)現(xiàn)單次給予藥物后，尿液中多胺類(lèi)和氨基酸類(lèi)含量升高，其時(shí)間要早于腎臟組織形態(tài)損傷和臨床上常規(guī)的腎毒性化學(xué)指標(biāo)。長(zhǎng)期給藥后，尿液中由腎毒性引起的氨基酸類(lèi)物質(zhì)的逐漸減少和腎臟組織中氨基酸類(lèi)、核苷類(lèi)物質(zhì)的減少一致，而且和對(duì)照組比較，支鏈氨基酸水平和給藥時(shí)間成正比。Chan和Cai［13］采用LC-MS方法研究大鼠給予馬兜鈴酸后尿液的代謝圖譜，從中發(fā)現(xiàn)了犬尿烯酸和馬尿酸兩種可反映藥物毒性的生物標(biāo)志物，可作為評(píng)價(jià)馬兜鈴酸毒性的生物學(xué)指標(biāo)。

3 基于胚胎干細(xì)胞的代謝組學(xué)方法在毒理學(xué)中的應(yīng)用進(jìn)展

近年來(lái)，各國(guó)學(xué)者對(duì)藥物毒性評(píng)價(jià)方法做了比較系統(tǒng)和深入的研究，毒理學(xué)替代法研究在國(guó)外發(fā)展十分迅速，體外替代實(shí)驗(yàn)的研究手段將細(xì)胞、組織培養(yǎng)與基因組學(xué)，蛋白組學(xué)和代謝組學(xué)有機(jī)地結(jié)合在一起，并增加了計(jì)算機(jī)模擬輔助評(píng)價(jià)系統(tǒng)。自2000年7月ECVAM正式批準(zhǔn)胚胎干細(xì)胞試驗(yàn)作為體外藥物和化合物毒性篩選動(dòng)物試驗(yàn)的替代方法，hESC在毒性評(píng)價(jià)中的應(yīng)用受到廣泛的關(guān)注;加之代謝組學(xué)能把人體等生物系統(tǒng)作為一個(gè)完整的系統(tǒng)進(jìn)行研究，著重考察這些生物系統(tǒng)的內(nèi)源性代謝物及其網(wǎng)絡(luò)在疾病和毒性作用中的意義及藥物作用下內(nèi)源性代謝物的變化規(guī)律，基于hESC的代謝組學(xué)研究在毒理學(xué)研究中日益受到關(guān)注。

盡管胚胎干細(xì)胞能模擬胚胎的早期發(fā)育，被用多種人類(lèi)疾病的體外模型，但有關(guān)胚胎干細(xì)胞產(chǎn)生的小分子物質(zhì)的動(dòng)態(tài)變化研究較少，在病理或化學(xué)藥物作用下，小分子代謝物如糖，有機(jī)酸，氨基酸和脂肪酸參與了細(xì)胞應(yīng)答的功能機(jī)制，這些小分子代謝物可以作為疾病和毒性反應(yīng)的候選生物標(biāo)志物。代謝組學(xué)利用核磁共振(NMR)或者質(zhì)譜技術(shù)可以對(duì)小分子代謝產(chǎn)物進(jìn)行準(zhǔn)確的檢測(cè)。利用胚胎干細(xì)胞和代謝組學(xué)技術(shù)的結(jié)合來(lái)評(píng)價(jià)發(fā)育毒性是由威斯康辛大學(xué)的Cezar等［14］首次提出，并進(jìn)行了較深的研究，采用一種已知的神經(jīng)發(fā)育毒性藥物丙戊酸鹽作用于胚胎干細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞來(lái)源的神經(jīng)前體細(xì)胞，收集細(xì)胞上清液進(jìn)行LC-MS檢測(cè)及分析，結(jié)果表明，色氨酸代謝的中間產(chǎn)物犬尿素(3-氨茴酰丙氨酸)和谷氨酸代謝產(chǎn)生的小分子代謝產(chǎn)物的含量有顯著的升高，并通過(guò)RT-PCR進(jìn)行了驗(yàn)證，提出犬尿素(3-氨茴酰丙氨酸)及其代謝產(chǎn)物可以作為癲癇藥物發(fā)育毒性的候選生物標(biāo)志物，胚胎干細(xì)胞蛻變中間產(chǎn)物可能作為預(yù)知和檢測(cè)藥物療效和毒性反應(yīng)的生物標(biāo)志物。

Paul等［15］利用胚胎干細(xì)胞和代謝組學(xué)相結(jié)合的方法來(lái)預(yù)測(cè)藥物的發(fā)育毒性。采用LC-MS的分析方法來(lái)檢測(cè)幾種有明確致畸性藥物刺激ESC后產(chǎn)生的小分子物質(zhì)含量的變化，這些小分子可以作為發(fā)育毒性的生物標(biāo)志物，能更加敏感的預(yù)測(cè)藥物的致畸性。除此之外，這種模型在后來(lái)的對(duì)維生素A和碘胺酮等八種藥物進(jìn)行盲法試驗(yàn)中，能準(zhǔn)確預(yù)測(cè)到七種藥物是否有致畸性。所以利用ESC和代謝組學(xué)的方法去尋找發(fā)育毒性的生物標(biāo)志物，這可以作為一種體外評(píng)價(jià)發(fā)育毒性的新思路。

4 展望

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外有關(guān)中草藥不良反應(yīng)的報(bào)道日見(jiàn)增多，在一定程度制約了中醫(yī)藥事業(yè)的現(xiàn)代化和國(guó)際化進(jìn)程，但目前尚無(wú)中藥毒性作用評(píng)價(jià)的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)及客觀依據(jù)。如何制定一套快速、準(zhǔn)確、客觀、敏感的中藥安全性評(píng)價(jià)體系是當(dāng)前中藥安全性評(píng)價(jià)亟待解決的問(wèn)題之一。

將代謝組學(xué)研究方法應(yīng)用于胚胎干細(xì)胞進(jìn)行毒理評(píng)價(jià)，考察藥物在接近常態(tài)狀況下對(duì)胚胎干細(xì)胞影響的生物學(xué)過(guò)程，考察毒性藥物作用前后胚胎干細(xì)胞的代謝物圖譜變化，通過(guò)與毒性靶器官細(xì)胞和整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)代謝組學(xué)毒性標(biāo)志物進(jìn)行對(duì)比分析，確定其關(guān)聯(lián)性，找出基于胚胎干細(xì)胞代謝組學(xué)毒性標(biāo)志物，發(fā)現(xiàn)一個(gè)或一組毒性作用的分子標(biāo)記物，并初步確定該(組)毒性標(biāo)志物的毒效范圍，進(jìn)而應(yīng)用于毒理作用評(píng)價(jià)，為今后中藥毒性評(píng)價(jià)提供快速、敏感、可靠的毒性標(biāo)志物。從而為中藥安全性評(píng)價(jià)開(kāi)辟一條全新的研究思路，并建立一套快速、敏感、高效的評(píng)價(jià)方法。

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