孫曉梅,夏雪山,代解杰
(1.中國醫(yī)學科學院/北京協(xié)和醫(yī)學院 醫(yī)學生物學研究所,昆明 650118;2.昆明理工大學 生命科學與技術學院,昆明 650224)
樹鼩馴養(yǎng)繁殖實驗動物標準及丙型肝炎動物模型技術平臺建設的探討
孫曉梅1,夏雪山2,代解杰1
(1.中國醫(yī)學科學院/北京協(xié)和醫(yī)學院 醫(yī)學生物學研究所,昆明 650118;2.昆明理工大學 生命科學與技術學院,昆明 650224)
目前用于生物醫(yī)學研究的樹鼩大多數(shù)來源于野生捕獲,由于個體間的差異較大,其實驗結果的均勻性和可重復性較差,亟待解決樹鼩人工飼養(yǎng)設施條件、繁殖關鍵技術、動物質量標準等一系列基礎科學問題。許多文獻報道了樹鼩與其他實驗動物比較,在肝病研究中具有巨大的開發(fā)應用潛力,在丙型肝炎動物模型研究中,亟待解決丙型肝炎病毒(HCV)細胞培養(yǎng)體系、HCV病毒感染劑量與感染途徑、HCV病毒對樹鼩體外、體內感染后病毒核酸檢測、抗體檢測和病理檢測等技術方法的建立及動物模型評價標準問題。本文就上述問題系統(tǒng)性地進行初步報道,旨在為樹鼩早日實現(xiàn)實驗動物化和丙型肝炎疾病研究中應用提供科學依據(jù)。
樹鼩;飼養(yǎng)繁殖;實驗動物標準;丙型肝炎;動物模型
樹鼩(Tupaia belangeri,tree shrew)是一種形似松鼠的小型哺乳動物。在分類學上,一直是許多學者感興趣和爭論的問題,一些學者根據(jù)其吻部較長,指(趾)端是爪,牙齒的數(shù)目和食性等特征把它列為食蟲目(Insectivora),另一些學者則根據(jù)其大腦比較發(fā)達而其上的嗅神經(jīng)區(qū)較小,眼眶后有骨橋并形成骨性眼眶,中耳部構造與狐猴相似,大拇指(趾)與其他指(趾)分開及牙齒具有前臼齒等特征把它列入靈長目(Primates)中的狐猴亞目。還有一些學者則提出另立新的目-攀鼩目(Scandentia)。不管樹鼩現(xiàn)在分類地位如何,自從1922年開始對它研究以來,有關樹鼩應用于醫(yī)學和生物學的研究論文就不斷產(chǎn)生,利用樹鼩開展的研究已涉及到形態(tài)解剖學、生態(tài)學、行為學、人類學、生物化學、遺傳學、心理學、神經(jīng)生理學、繁殖生物學、胚胎學、寄生蟲學、病毒學、免疫學、病理學以及運動生理、急慢性壓力的影響和應激等社會生物學的研究。
樹鼩在生物醫(yī)學中的應用前景越來越受到世界各地相關研究者的重視。然而目前困擾學者的最大問題是,現(xiàn)在供研究的樹鼩還未實驗動物化,相關的實驗動物標準還未出臺,規(guī)?;膶嶒炇荫Z養(yǎng)繁殖還非常少。以中國醫(yī)學科學院醫(yī)學生物學研究所為首的,與昆明理工大學合作,目前在樹鼩的馴養(yǎng)繁殖、實驗動物標準化和樹鼩丙型肝炎動物模型建立等方面做了很多研究與探索,已經(jīng)取得可喜得的成績。
中國醫(yī)學科學院醫(yī)學生物學研究所自1982~1993年就開始進行樹鼩的馴養(yǎng)繁殖及動物模型建立的研究,在當時已成功建立輪狀病毒動物模型。2006年開始進行規(guī)模化的野生樹鼩的馴養(yǎng)繁殖工作,經(jīng)過四年的歷程,取得非常好的成效。
1.1 野生樹鼩的馴化
眾所周知,樹鼩的“應激反應”遠遠超過靈長類動物,野生樹鼩引種至實驗室進行人工飼養(yǎng)首先要解決動物因應急反應造成的大規(guī)模死亡問題。作者應用實驗動物飼養(yǎng)繁殖技術結合樹鼩生物學特性,創(chuàng)新性地研制了樹鼩馴化及繁殖的生態(tài)型不銹鋼籠具(尺寸:3000 mm×4000 mm×2000 mm,每籠懸掛600 mm×200 mm×400 mm巢箱4~5個),將野外引種的樹鼩按40~50只/籠放入該籠具進行人工飼養(yǎng)馴化10~12周,可大大降低樹鼩的“應激反應”,同時逐步適應人工飼養(yǎng)的環(huán)境條件和飲食習慣,死亡率可控制在5%以下。
1.2 樹鼩繁殖的關鍵技術
將馴化好的野生樹鼩轉入人工飼養(yǎng)及實驗用樹鼩專用籠具(專利號:ZL2008 2 0199835.4)進行配對繁殖。經(jīng)過大膽嘗試和探索,室內溫度控制在25~28℃,相對濕度30% ~50%,每天人工光照12 h,光照強度150~200 lx即可。飼料營養(yǎng)配比為:水分30%、粗蛋白 25%、粗脂肪 6%、無氮浸出物24.5%、粗纖維6%、粗灰分6%、鈣1.5%、磷1%,并補給適量的水果、面包蟲等營養(yǎng)品。已經(jīng)掌握了樹鼩交配規(guī)律、妊娠判定、產(chǎn)前準備、圍產(chǎn)期護理等一系列關鍵技術,順利建立了種群,現(xiàn)有400余對種群,存欄量>1000余只(其中子代樹鼩500余只)。繁殖率>85%,成活率 >88.23%,每窩平均產(chǎn)仔數(shù)(3.62±0.74)只。成功建立了樹鼩繁育的關鍵技術(專利申請?zhí)枺?00910095042.7)。在此基礎上制訂了《樹鼩飼養(yǎng)管理技術規(guī)范(研究稿)》包括引種技術、馴化技術、飼養(yǎng)觀察技術、營養(yǎng)飼料配制技術、繁殖技術、環(huán)境條件控制技術和疾病控制技術。
2.1 樹鼩的質量標準控制
我們對樹鼩進行了實驗動物質量標準的研究,已完成微生物學指標本底的檢測,腸道細菌為大腸桿菌和葡萄球菌,也伴有假單胞菌、沙門氏菌、鏈球菌的感染。完成樹鼩體外寄生蟲的檢測,樹鼩體外自然感染寄生蟲主要是虱子、螨蟲,偶見蜱蟲。完成樹鼩病毒抗體的檢測,其自然感染主要是單純皰疹病毒、輪狀病毒、柯薩奇病毒血清抗體呈陽性。
2.2 樹鼩的遺傳學控制
建立了樹鼩隨機擴增多肽RAPD遺傳標記分析方法(40條隨機引物),和微衛(wèi)星分子標記(12對引物)的遺傳檢測方法,遺傳多態(tài)檢測結果表明我們飼養(yǎng)繁殖的樹鼩群體具有較好的遺傳多樣性。
建立了樹鼩血常規(guī)參數(shù)和肝功能指標的正常值數(shù)據(jù)庫,在此基礎上制訂了《樹鼩生物學特性數(shù)據(jù)檢測技術規(guī)范(研究稿)》,為樹鼩在醫(yī)學研究中的應用提供了基礎數(shù)據(jù)。下一步的目標是建成全國的樹鼩種質資源庫基地,為生物醫(yī)藥研究提供合格的實驗動物化的樹鼩。
建立了樹鼩麻醉技術,麻醉劑主要有戊巴比妥鈉(50 mg/kg)、鹽酸氯胺酮(40 mg/kg),一定劑量的鹽酸氯胺酮和戊巴比妥鈉均能對樹鼩產(chǎn)生麻醉效果,并安全可靠;鹽酸氯胺酮顯效快、麻醉維持時間短,戊巴比妥鈉則麻醉維持時間長,動物非常安定。
建立了實驗樹鼩保定技術(自制的捕捉保定袋)、采血技術(尾靜脈采血可達到每次1.5 mL,股靜脈采血可達到每次3 mL,心臟采血可達到每次5~6 mL),實驗樹鼩灌胃給藥技術。在此基礎上制訂了《樹鼩動物實驗基本操作技術規(guī)范(研究稿)》。
5.1 穩(wěn)定、高效的 HCV病毒(J6/JFH-1)細胞培養(yǎng)體系
從重組痘病毒(vTF7-3)感染的敏感細胞中選出Hela細胞作為國際公認的HCV病毒株(J6/JFH-1)的受染細胞,通過測定轉染細胞中 HCV RNA合成、結構蛋白和非結構蛋白的表達情況以及HCVcc結構形態(tài),建立及優(yōu)化病毒株(J6/JFH-1)的細胞轉染體系。通過RT-PCR、Western blot及感染Huh7等方式建立每批次HCVcc的核酸、蛋白及感染效率質量控制標準,為樹鼩HCV感染模型的研究工作提供穩(wěn)定質量控制的 HCVcc(病毒載量達到108copies/mL),所得到的 HCV細胞培養(yǎng)病毒上清液,具有HCV病毒復制性和感染性。
5.2 樹鼩原代肝細胞分離培養(yǎng)及HCV對其感染性研究
采用活體腹腔肝臟暴露,二步灌流、膠原酶消化法獲得樹鼩原代肝細胞,每次分離的原代肝細胞產(chǎn)量達5×108以上,細胞純度達95%以上,細胞成活率為90%,通過多種培養(yǎng)基培養(yǎng)實驗,建立了樹鼩原代肝細胞培養(yǎng)。結合樹鼩原代肝細胞(PTH)生長曲線特征,選擇其指數(shù)生長初期(2~4 d),以高毒力J6/JFH-1嵌合型 HCVcc(病毒載量 1×108IU/mL;病毒滴度1×106ffu/mL)對子代小樹鼩原代肝細胞進行感染獲得HCVcc感染PTH病毒增殖動力曲線,結果顯示,病毒在PTH中隨時間的變化有明顯的增殖變化,其中第1天和9天 HCV RNA增殖最高水平可達5.5 Log10 IU/mL、5.2 Log 10 IU/mL,細胞上清RT-PCR檢測成陽性,測序結果比對分析正確,并證實該PTH產(chǎn)生上清對人肝癌(Huh7.5.1)細胞具有較好感染性。在此基礎上制訂了《HCV病毒感染樹鼩原代肝細胞模型制作技術規(guī)范(研究稿)》。
5.3 樹鼩IgG抗體的制備
采用辛酸-硫酸銨沉淀并結合Sephacryl-S200凝膠過濾層析和DEAE-Sephadex A-50陰離子交換層析分離純化樹鼩血清免疫球蛋白G(IgG),樹鼩血清中IgG的分子量約為160×103,其重鏈分子量為53.5×103,輕鏈分子量為28.4×103。成功的制備了特異性好、質量高的兔抗樹鼩IgG的多克隆抗體其效價達1∶25 600;同時得到了大量的高濃度鼠抗樹鼩的IgG單克隆產(chǎn)量約為1~5 mg/mL。在已得到的樹鼩IgG多抗和單抗的基礎上,建立了ELISA和Western blotting的檢測方法。申請發(fā)明專利:抗樹鼩 IgG單克隆抗體的制備方法(申請?zhí)枺?00910094864.3)
5.4 樹鼩中HCV受體和抗體的研究
為了從樹鼩中HCV的受體的角度進一步證實其作為HCV的感染動物模型的可能性和初步對HCV的慢性感染機制。以樹鼩肝組織中提取的核酸為模板,擴增了CD81(711 bp)、SR-BI(1041 bp)、Claudin-1(636 bp)三個受體基因片段,并以各受體基因片段PCR產(chǎn)物通過TA克隆完成測序,在此基礎上進行了它們和不同物種間的保守性和序列差異性分析。結果發(fā)現(xiàn):與人相比較,核苷酸序列同源性CD81、SR-BI、Claudin-1分別為 91.4%、87.5% 和90.9%;氨基酸序列同源性三個分子分別為96.2%、88.0%和93.4%。經(jīng) HCV感染受體關鍵位點分析發(fā)現(xiàn),CD81分子與人有9個差異性位點,6個在胞外大環(huán)區(qū)(LEL區(qū)),HCV感染所需的關鍵位點與人基本一致;Claudin-1共有14氨基酸位點與人類有差異,胞外大環(huán)區(qū)有3個。SR-BI受體氨基酸序列與人有較大差異,61個差異位點中LEL區(qū)有44個。相比而言,所研究的樹鼩的CD81和 SR-BI受體更接近于靈長類動物而遠于鼠類。
5.5 樹鼩CD81熒光實時定量PCR技術
根據(jù)CD81核苷酸序列,設計并合成了引物和Taqman探針,并對其反應條件進行了優(yōu)化,結果發(fā)現(xiàn):在25 μL反應體系中,反應主要條件為退火溫度60℃、引物濃度 200 nmol/L、探針濃度100 nmol/L。經(jīng)已知拷貝數(shù)標本(103、104、105、106、107拷貝)進行檢測,繪制了標準曲線,CT值與拷貝數(shù)的對數(shù)值之間有很好的相關性(R2=0.9996)。通過批間、批內、組間、組內四個水平對該方法進行了重復性、穩(wěn)定性評價,確定該方法具有較高的穩(wěn)定性和可重復性,各項變異系數(shù)均小于5%。經(jīng)檢測靈敏性評價,該方法可以檢測到每個反應相當于1×102copies CD81核酸分子。對 HCV感染不同時間(8、12、16、20 h和24 h)的樹鼩原代肝細胞(PTH),進行了HCV-RNA檢測,并用該方法檢測了其CD81分子表達量,結果發(fā)現(xiàn):在HCV感染不同時間的PTH中可以檢測到HCV-RNA,隨著HCV的感染和增殖,樹鼩中CD81的表達量下降,下降曲線無規(guī)律性。該方法已申請發(fā)明專利:以樹鼩CD81基因構建的質粒為標準品的Taqman探針熒光定量PCR方法(申請?zhí)枺?00810233735.3)。
5.6 HCV病毒體內感染模型
用國際公認的(J6/JFH1)標準毒株培養(yǎng)的HCV病毒培養(yǎng)液(HCVcc)靜脈或肝臟注射等方式,在具有生物安全保護的專用實驗籠具——獨立換氣樹鼩專用隔離籠具(專利申請?zhí)枺?01020242799.2)體內感染F1代仔樹鼩,約20% ~25%的樹鼩在2~18周相繼出現(xiàn)病毒血征或呈慢性持續(xù)性感染癥狀,病毒載量在102~105copies/mL之間,肝功能中 ALT指標最高可達到265 U/L,進一步證實樹鼩可作為HCV病毒感染研究的實驗動物。對感染樹鼩進行肝臟活體病理學檢測發(fā)現(xiàn),肝細胞損傷或部分組織纖維化,進一步證實樹鼩可作為HCV病毒感染研究的實驗動物。在此基礎上制訂了《HCV病毒感染樹鼩模型制作技術規(guī)范(研究稿)》。
樹鼩能否替代黑猩猩成為HCV疾病動物模型研究、抗HCV藥物和疫苗篩選與評價的理想實驗動物?必須解決樹鼩的實驗動物化標準的一系列基礎科學問題,尤其是遺傳學特性研究,對于提高目前樹鼩對HCV病毒感染率不高將有重要意義。同時,HCV感染樹鼩后,樹鼩的細胞免疫和體液免疫的檢測技術方法的建立,是評價病毒感染樹鼩免疫機制的重要的技術手段。相信在不遠的將來,樹鼩將會成為實驗動物家族中的一個新成員,為人類健康做出應有的貢獻。
Exploration of laboratory animal standard of domesticated and bred Tupaia belangeri and construction of a technology platform of a Tupaia belangeri model of hepatitis C virus(HCV)infection
SUN Xiao-mei1,XIA Xue-shan2,DAI Jie-jie1
(1.Institute of Medical Biology,Chinese Academy of Medical Science and Peking Union Medical College,Kunming 650118,China;2.Faculty of Life Science and Technology,Kunming University of Science and Technology,Kunming 650224)
At present,the Tupaia belangeri used for biomedical studies is mainly sourced from wild field capture.Due to the variation of interindividual differences,there are still some shortages in the homogeneity and the repeatability of experiments on those animals.There are problems demanding prompt solution on a series of basic scientific questions such as the management,critical techniques for breeding and the animal quality control standard in Tupaia belangeri.A lot of researches have reported that the Tupaia belangeri has a huge exploitation potential on the liver disease research compared with other laboratory animals.In the studies of animal models of hepatitis,there are problems need to be solved promptly on the cell culture system of HCV(hepatitis C virus),the infection dosage and route of HCV infection,the RNA,the antibody and the pathological examination after HCV infection in vivo and in vitro,and also how to evaluate the animal model.This paper will briefly discuss the above mentioned questions,in order to provide a scientific basis for implementing experimental animalization and the use of the Tupaia belangeri in HCV disease studies.
Tupaia belangeri,Domestication;Breeding;Standard of experimental animals,Hepatitis C,Animal model
Q95-33
A
1005-4847(2011)02-0172-04
10.3969/j.issn.1005-4847.2011.02.017
國家科技支撐計劃重點項目(批準號:2009BAI83B02),云南省科技基礎條件平臺建設計劃項目(編號:2006PT07-2)。
孫曉梅(1963-),女,研究方向:實驗動物學及疾病動物模型。Email:sxm@imbcams.com.cn
代解杰,研究員,項目負責人。Email:lzldjj@gmail.com夏雪山,教授。Email:oliverxia2000@yahoo.com.cn
2010-12-27