文│朱芳賢（全國(guó)畜牧總站畜禽遺傳資源保存利用中心 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院）

劉丑生 趙俊金（全國(guó)畜牧總站畜禽遺傳資源保存利用中心）

凍精保種對(duì)我國(guó)地方豬種資源保護(hù)，乃至豬聯(lián)合育種工作將具有積極的社會(huì)意義和經(jīng)濟(jì)意義，希望各相關(guān)科研單位能夠加大對(duì)這方面技術(shù)的研發(fā)與改進(jìn)力度，以便能很好地適應(yīng)現(xiàn)階段養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展進(jìn)程，充分發(fā)揮優(yōu)良地方豬種優(yōu)良基因的作用。

近來(lái)豬種資源數(shù)量持續(xù)下降，甚至有加劇的趨勢(shì)。表現(xiàn)在：一是資源數(shù)量減少，據(jù)《中國(guó)畜禽遺傳資源狀況》（2004年）統(tǒng)計(jì)，全國(guó)有40%以上的地方豬品種群體數(shù)量有不同程度的下降，相繼有14個(gè)地方豬品種被確定為瀕危資源，有5個(gè)品種被確定為瀕臨滅絕資源，深縣豬、項(xiàng)城豬、豪桿嘴型內(nèi)江豬、大普吉豬等4個(gè)品種（類群）已滅絕；同時(shí)，品種內(nèi)遺傳多樣性豐富度降低，許多地方品種（類群）的母豬數(shù)量急劇下降，公豬頭數(shù)與血統(tǒng)數(shù)銳減，品種內(nèi)的遺傳多樣性日益縮小，遺傳變異日益枯竭，遺傳基礎(chǔ)愈來(lái)愈狹窄。

豬冷凍精液是遺傳資源保護(hù)及育種的一種有效手段，然而目前養(yǎng)豬業(yè)中限制冷凍精液應(yīng)用的因素很多，公認(rèn)的主要原因有冷凍精液的受精率比新鮮精液低，不同公豬精液冷凍效果的差異大，每一次輸精需要大量精子以及生產(chǎn)成本高等。其他因素有缺乏可靠的評(píng)定精液品質(zhì)的實(shí)驗(yàn)室方法，難于掌握適時(shí)輸精、精液冷凍和解凍的方法復(fù)雜，以及豬場(chǎng)不易得到液氮供應(yīng)等。

雖然豬冷凍精液解凍后活力和受精能力在短時(shí)間內(nèi)不可能有大的提升，但隨著畜牧科技人員掌握凍精最佳輸精時(shí)間技術(shù)的提高，相關(guān)設(shè)備的投入與改進(jìn)，繁殖新技術(shù)的發(fā)展和運(yùn)用，以及輸精劑量和次數(shù)的增加，凍精的受胎率可達(dá)到理想的水平，從而使得目前看來(lái)受胎率不理想的豬冷凍精液在將來(lái)的遺傳資源保護(hù)利用中有好的應(yīng)用前景。

一、掌握適時(shí)授精時(shí)間提高母豬分娩率的可能性

隨著畜牧科技人員對(duì)凍精最佳輸精時(shí)間了解程度的提高，在使用凍精配種過(guò)程中可根據(jù)不同品種、不同胎次、不同年齡的母豬發(fā)情期長(zhǎng)短作好發(fā)情鑒定；從母豬陰戶紅腫程度、顏色和干濕度黏液透明度和顏色，用手掌按壓母豬臀部甚至騎在背部等方法來(lái)確定凍精最佳輸精時(shí)間，從而提高凍精配種受胎率。

應(yīng)用B超準(zhǔn)確地鑒定母豬卵泡發(fā)育，掌握適時(shí)授精是提高凍精配種受胎率極其重要的措施。國(guó)內(nèi)外的研究發(fā)現(xiàn)，B超在獸醫(yī)疾病診斷、人工授精、胚胎移植中鑒定卵泡發(fā)育和早期妊娠檢測(cè)均有快速、準(zhǔn)確和精確的特點(diǎn)，B超和腹腔鏡將成為未來(lái)人工授精中必備的工具。隨著相關(guān)儀器價(jià)格的下降，國(guó)外一些先進(jìn)企業(yè)在種豬繁殖育種過(guò)程中利用B超和腹腔鏡的越來(lái)越多，相信國(guó)內(nèi)對(duì)其應(yīng)用也將越來(lái)越多。

Waberski等1994年的實(shí)驗(yàn)證明了對(duì)最佳授精時(shí)間的選擇是提高母豬分娩率的關(guān)鍵因素之一，其實(shí)驗(yàn)結(jié)果為：授精時(shí)間在預(yù)計(jì)排卵前8小時(shí)以上時(shí)，受胎率為0%（0/16）；排卵前8～4小時(shí)，授精分娩率為70%（104/145）；排卵前4小時(shí)，授精母豬受胎率為100%、分娩率為88.1%；排卵后4小時(shí)內(nèi)，授精受胎率為68.5%、分娩率為50%。Bolarin等（2006）研究了407頭自發(fā)排卵母豬，每次授精只使用含10億精子的冷凍精液，在接近排卵時(shí)間（超聲波檢查）時(shí)采取子宮深部授精，獲得超過(guò)80%的產(chǎn)仔率和10頭以上胎產(chǎn)仔數(shù)，也證實(shí)了準(zhǔn)確確定發(fā)情排卵時(shí)間在授精中的重要性。

二、子宮深部授精方式的發(fā)展和運(yùn)用

到目前為止，豬人工授精一般都是應(yīng)用一次性海綿頭的輸精管在子宮頸深部授精。子宮頸內(nèi)授精會(huì)有大量的精子（約25億）輸進(jìn)子宮頸后部的皺褶，大多數(shù)的母豬在輸精時(shí)和之后會(huì)表現(xiàn)出精液逆流現(xiàn)象，因而，大約30%～40%輸入子宮頸管的精子，會(huì)在授精后1小時(shí)內(nèi)從管中流出。同時(shí)，超過(guò)90%的精子在授精后2～3小時(shí)內(nèi)被母豬的生殖系統(tǒng)——子宮頸、子宮、子宮輸卵管連接部、輸卵管壺峽連接部篩選排斥。這種精子的大量流失限制了能夠到達(dá)子宮輸卵管連接處的精子數(shù)。向成年母豬授精30億冷藏精子，只有大約10萬(wàn)成功的達(dá)到了子宮輸卵管連接處，大約1000個(gè)精子達(dá)到了輸卵管峽部的精子儲(chǔ)存庫(kù)。此外，在精子質(zhì)量差時(shí)這種損失更為嚴(yán)重，比如解凍后的精子。實(shí)際上，在輸卵管中凍精的有效精子數(shù)一般比冷藏的低十倍。

隨著輸精技術(shù)的改進(jìn)——輸精器改進(jìn)和手術(shù)、腹腔鏡法等新的子宮角輸精法（deep uterineinsemination，DUI）的采用，將精液輸?shù)阶訉m頸后更深部位能夠使更多的精子到達(dá)子宮輸卵管連接部。與常規(guī)的子宮頸內(nèi)授精相比，子宮深部授精方式可以減少每次輸入的冷藏精子數(shù)目。要達(dá)到子宮頸內(nèi)授精（每次30億以上精子）的受精效果，可以期待由每次輸精1億～1.5億（子宮深部授精）得到。因此，這種方式被視為接近在生產(chǎn)條件下使用冷凍精液的實(shí)用、有效授精方式。特別是在精液有限，高質(zhì)量的種公豬的精液需要得到盡可能有效的使用，或者保種需要的情況下。

1.輸精器改進(jìn)。Martinez 等（2001）采用一種柔性光纖內(nèi)窺鏡（長(zhǎng)度：1.35米；外直徑：3.3毫米；內(nèi)直徑：1.2毫米）實(shí)現(xiàn)了子宮角輸精。這種輸精裝置插入到子宮角只需4.1±0.26分鐘，應(yīng)用這種子宮角輸精法，輸精效果（鮮精，每次10億、2億、0.5億）與常規(guī)輸精法（鮮精，每次30億）在產(chǎn)仔率與平均窩產(chǎn)仔數(shù)上差異不顯著；Rocaetal等（2003）采用激素誘導(dǎo)，一次子宮角輸精使冷凍精液的輸精量降為10億/次，產(chǎn)仔率與平均窩產(chǎn)仔數(shù)分別達(dá)到77.55%，9.31頭；Bolar′netal等（2006）對(duì)自然發(fā)情母豬進(jìn)行2次子宮角輸精（10億/次），產(chǎn)仔率與平均窩產(chǎn)仔數(shù)也分別達(dá)到70.1%，9.18頭；法國(guó)卡蘇公司等在使用冷凍精液授精時(shí)改進(jìn)了授精管，在海綿頭授精管的內(nèi)部設(shè)置一條細(xì)的導(dǎo)管，當(dāng)授精管插入子宮頸深部后再推進(jìn)內(nèi)置的細(xì)導(dǎo)管，直到子宮角的彎曲部，這樣精液能直接輸入子宮內(nèi)或子宮角，使用這種方法，據(jù)研究，用有授精能力的5億～6億精子和平常使用30億精子無(wú)顯著差異；Vazquez等（2001）在西班牙對(duì)329只經(jīng)產(chǎn)母豬使用子宮深部授精（1.5億冷藏精子/次）1次、2次或3次以及子宮頸內(nèi)授精（30億冷藏精子/次），產(chǎn)仔率為83.3%～87.3%，胎產(chǎn)仔數(shù)在9.2～10.4個(gè)；Day等（2003）在美國(guó)對(duì)105只經(jīng)產(chǎn)母豬分別采用2次子宮深部授精1.5億冷藏精子或者子宮頸內(nèi)授精30億冷藏精子，產(chǎn)仔率分別為83%、90%，二者沒(méi)有顯著差異。

2.外科手術(shù)植入。最近的研究顯示，最少1000萬(wàn)冷藏精子通過(guò)外科手術(shù)植入子宮輸卵管結(jié)合部，受孕率高達(dá)89%。

3.腹腔鏡法。比起剖腹手術(shù)把精液直接輸入子宮，腹腔鏡法是一種創(chuàng)傷較小的手術(shù)，并且是可在大的養(yǎng)殖場(chǎng)中培訓(xùn)推廣的技術(shù)。意大利完成的一項(xiàng)試驗(yàn)中，F(xiàn)antinati等（2005）通過(guò)腹腔鏡把精子輸入接近子宮輸卵管連接處，達(dá)到高受胎率所需的冷藏精子數(shù)量可以減少至每個(gè)子宮角500萬(wàn)個(gè)精子，這種腹腔鏡技術(shù)已經(jīng)被證明可用于受胎率更低的性控精液輸精。最近還有報(bào)道稱，使用腹腔鏡法每個(gè)子宮角輸入30萬(wàn)個(gè)性別分離精子，受孕率可達(dá)80%。

三、繁殖新技術(shù)的發(fā)展和運(yùn)用

隨著激素調(diào)控敏化子宮、單精子顯微注射和克隆技術(shù)等繁殖新技術(shù)的發(fā)展和運(yùn)用，豬的凍精有了更加廣闊的利用前景，尤其是活體滅絕豬種的凍精更有價(jià)值。

1.敏化子宮。用激素讓子宮變得敏感，提高受胎率的方法目前在養(yǎng)豬生產(chǎn)中有應(yīng)用，比如在每份精液中加入催產(chǎn)素、前列腺素；一些試驗(yàn)在輸精前加入人工合成的精漿制品；用不育的公豬與小母豬交配；用死精給小母豬輸精等，目的都是試驗(yàn)激素對(duì)子宮的影響程度。施學(xué)仕（2007）在每份精液中加入律胎素（PGF2a）0.5～1.0毫升，1557頭母豬產(chǎn)仔率與平均窩產(chǎn)仔數(shù)分別達(dá)到83.80%，10.15頭，未添加者（1552頭）產(chǎn)仔率與平均窩產(chǎn)仔數(shù)為86.80%，10.28頭；精液中加入合成精漿MR-A Predil，296頭母豬產(chǎn)仔率與平均窩產(chǎn)仔數(shù)分別達(dá)到83.80%，10.15頭，未添加者（324頭）產(chǎn)仔率與平均窩產(chǎn)仔數(shù)為82.07%，10.04頭；據(jù)嚴(yán)家清（2001）介紹，在冷凍精液解凍后添加PGF2a，并且授精時(shí)間適宜，母豬的分娩率在80%～100% ，窩產(chǎn)仔數(shù)平均為8.1～11.7頭。原因是精液經(jīng)冷凍保存后，精子壽命縮短，若過(guò)早或過(guò)遲到達(dá)受精部位，均會(huì)失去受精的機(jī)會(huì)。由精液成分分析得知，鮮精內(nèi)PGF2a的含量在200微克/升左右，冷凍后大部分被破壞，不能刺激母豬子宮和輸卵管的蠕動(dòng)，精子不能在正常的時(shí)間內(nèi)游動(dòng)到受精部位。

2.單精子顯微注射。單精子顯微注射是新興助孕技術(shù)，出現(xiàn)于1992年，即在體外用機(jī)械注射方法將單個(gè)精子注入到卵子的胞質(zhì)內(nèi)，卵裂達(dá)一定程度時(shí)移回宮腔。

3.克隆技術(shù)。自從1997年Dolly羊誕生，克隆技術(shù)在整個(gè)生物界成為熱點(diǎn)，2000年“陽(yáng)陽(yáng)”的問(wèn)世，彌補(bǔ)了我國(guó)山羊克隆技術(shù)的又一空白。無(wú)論是胚胎克隆，還是體細(xì)胞克隆，都能發(fā)育為一個(gè)正常的個(gè)體。利用此技術(shù)，只要有瀕危物種的胚胎細(xì)胞或者體細(xì)胞，那么都有可能使其生長(zhǎng)為一個(gè)正常的個(gè)體。據(jù)2002年新加坡的一位學(xué)者報(bào)道，他領(lǐng)導(dǎo)的研究小組從已經(jīng)滅絕10多年的Gaur calf標(biāo)本的皮膚組織中，利用體細(xì)胞克隆技術(shù)克隆出了一只Gaur calf，使這一物種重新回到了生物界。這提示人們，某些已經(jīng)滅絕的物種仍有可能會(huì)幸運(yùn)地獲得新生，給動(dòng)物遺傳資源的保護(hù)工作提供了一條新途徑。

四、增加輸精劑量和次數(shù)以提高豬凍精受胎率的效果

1.增加輸精劑量。Waston & Behan（2002）在英國(guó)每次使用10億精子通過(guò)子宮頸后授精技術(shù)給3240只經(jīng)產(chǎn)母豬輸精，產(chǎn)仔率為88.7%，胎仔數(shù)為12.1只，與子宮頸內(nèi)授精的產(chǎn)仔率91.3%，胎仔數(shù)12.5個(gè)相比無(wú)顯著差異。然而，Roberts & Bilkei（2005）在匈牙利和克羅地亞對(duì)1783只經(jīng)產(chǎn)母豬分別使用10億精子子宮頸后授精和30億精子子宮頸內(nèi)授精，盡管兩者在產(chǎn)仔率上相似，但子宮頸后授精的母豬胎產(chǎn)數(shù)卻明顯少（前者10.2只，后者12.3只），這些結(jié)果與Rozeboom等（2004）于美國(guó)研究報(bào)道一致。當(dāng)嘗試更少輸精數(shù)量時(shí)，即每次輸精5億精子，產(chǎn)仔率和胎仔數(shù)降低。說(shuō)明凍精輸精受胎率與輸精劑量呈正相關(guān)。

2.增加輸精次數(shù)。Reed等在1984年報(bào)告凍精輸精受胎率與每個(gè)情期的輸精次數(shù)也呈正相關(guān)。

五、結(jié)論

凍精保種對(duì)我國(guó)地方豬種資源保護(hù)，乃至豬聯(lián)合育種工作具有積極的社會(huì)意義和經(jīng)濟(jì)意義。就現(xiàn)在很多地方豬種種群個(gè)體數(shù)量銳減，一些豬種滅絕，一些豬種面臨滅絕的現(xiàn)狀而言，希望各相關(guān)科研單位能夠加大在這方面技術(shù)的研發(fā)與改進(jìn)力度，以便能很好地適應(yīng)現(xiàn)階段養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展進(jìn)程，充分發(fā)揮優(yōu)良地方豬種優(yōu)良基因的作用。各級(jí)部門應(yīng)制作并保存地方豬種凍精，進(jìn)行保種工作宜早不宜遲。