李守業(yè)，朱 妍，焦 悅，李昌煜

(浙江中醫(yī)藥大學(xué)，浙江 杭州 310053)

阿爾采末病(Alzheimer’s disease，AD)又稱老年性癡呆，是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。老年斑(senile plaques，SP)是其主要病理特征之一，β-淀粉樣蛋白(betaamyloid protein，Aβ)是SP的核心成分。以往研究證實(shí)，Aβ腦內(nèi)異常代謝和沉積是AD發(fā)病的中心環(huán)節(jié)和共同途徑。其中，Aβ由淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein，APP)經(jīng)α、β和γ分泌酶剪切生成，而APP過度表達(dá)及異常裂解是Aβ沉積的始動(dòng)因素。因此，抑制和減少APP的過度產(chǎn)生是治療AD的重要策略之一。

1 APP

APP是21號染色體上的一個(gè)含有Aβ全部密碼的基因編碼蛋白質(zhì)，結(jié)構(gòu)具有同嗜性和異嗜性相互作用的特點(diǎn)。APP還具有組織器官特異性，其分布在心、腦、腎含量較高，尤以神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞中含量最為豐富。既往研究表明，APP的二聚作用能夠?qū)е翧β腦內(nèi)積聚，但近來發(fā)現(xiàn)，APP家族中的另外兩個(gè)成員APLP1和APLP2則會減少Aβ極性二聚體的形成［1］。

正常情況下，APP作為體內(nèi)炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)、凝集反應(yīng)及組織損傷、修復(fù)等生物過程中的重要物質(zhì)，具有促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞生長分化、增強(qiáng)神經(jīng)突觸可塑性、參與細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及促進(jìn)細(xì)胞黏附的功能。而APP的功能主要依賴于其裂解片段可溶性的 APPs(sAPPα)和 APP蛋白胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(AICD)［2］。其中，sAPPα對神經(jīng)細(xì)胞具有營養(yǎng)和保護(hù)作用，AICD則能夠調(diào)節(jié)p53、腦啡肽酶等基因的表達(dá)。

APP裂解存在兩種途徑［3］:①主要裂解途徑在Aβ序列間，裂解酶為α分泌酶，此途徑不形成Aβ;②次要裂解途徑在Aβ序列兩側(cè)，其裂解酶為β分泌酶和γ分泌酶，能夠產(chǎn)生全長的Aβ。病理狀態(tài)下，APP的次要裂解途徑對Aβ的形成和積聚發(fā)揮著主要作用。

2 分泌酶

2.1 α分泌酶 α分泌酶是一種解聚素和金屬蛋白酶(a disintegrin and metalloprotease，ADAM)，現(xiàn)已證明 ADAM9、ADAM10和ADAM17均具有α分泌酶活性［4］。近來研究提示，促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可能是α分泌酶調(diào)節(jié)中PKC依賴、PKC非依賴及酪氨酸激酶的3條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路共同作用的效應(yīng)系統(tǒng)，激活PKC和MAPK信號通路能明顯刺激APP的α 分泌酶裂解［5］。

MAPK信號通路在N-甲基-D-天門冬氨酸(NMDA)受體介導(dǎo)的sAPPα釋放上也起關(guān)鍵作用，衍生于雷沙吉蘭(rasagiline)的膽堿酯酶抑制劑TV3326和TV3279可通過MAPK通路調(diào)節(jié)APP的α分泌酶代謝，增加sAPPα的分泌［6］。此外，O位N-乙酰葡萄糖胺轉(zhuǎn)移酶通過調(diào)控APP蛋白的O位N-乙酰葡萄糖胺糖基化修飾水平，增加非淀粉樣α分泌酶的產(chǎn)生，進(jìn)而增加具有神經(jīng)元保護(hù)作用的sAPPα碎片產(chǎn)生和減少Aβ的分泌。這提示通過對O位N-乙酰葡萄糖胺糖基化的修飾，可以作為一種以α分泌酶為靶點(diǎn)的AD潛在治療途徑［7］。

此外，Tian等［8］首次提出α分泌酶具有雙重作用，并證明α分泌酶是一種可能的γ分泌酶抑制劑。因此，增加腦內(nèi)α分泌酶的活性既可以防止Aβ的形成，其產(chǎn)生的sAPPα又具有神經(jīng)營養(yǎng)和保護(hù)作用，將成為治療AD的新方法。

2.1.1 ADAM9 ADAM9最初是從小鼠肺的cDNA文庫中分離得到，主要是在Aβ序列的His14-Gln15位上起作用。ADAM9和APP共表達(dá)可使sAPPα水平升高，sAPPα的組成性分泌也增加。通過對ADAM9基因啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行篩選發(fā)現(xiàn)，其具有4種多態(tài)性:－542C/T(rs10105311)，－600A/C(rs7840270)， －963A/G(rs6991968)和 －1314T/C(rs7006414)。雌激素治療過程中還發(fā)現(xiàn)，ADAM9的轉(zhuǎn)錄活性增加，ADAM9基因啟動(dòng)子的多態(tài)性調(diào)控其轉(zhuǎn)錄，并可治療散發(fā)性AD［9］。另外，ADAM9還能提高腫瘤細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移能力，提示其與腫瘤發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移也可能具有一定關(guān)系。

2.1.2 ADAM10 ADAM10是細(xì)胞膜上一種重要的調(diào)節(jié)分子，它主要通過調(diào)節(jié)膜內(nèi)蛋白水解，引起底物分子的胞外功能區(qū)脫落，進(jìn)一步啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、生長及炎癥反應(yīng)等。

ADAM10的5'非翻譯區(qū)在其表達(dá)的后轉(zhuǎn)錄調(diào)控中起著重要作用。研究表明，ADAM10的5'非翻譯區(qū)能夠抑制其報(bào)告基因的翻譯，雖然5'非翻譯區(qū)缺陷的HEK293細(xì)胞(人胚腎細(xì)胞－293)mRNA水平未改變，但其蛋白水平卻顯著增加［10］。ADAM10過表達(dá)還可以減輕APP V717I轉(zhuǎn)基因AD大鼠中相關(guān)的功能紊亂，并且體內(nèi)ADAM10在其酶的作用下可以抑制AD大鼠認(rèn)知功能障礙，改善其學(xué)習(xí)記憶能力［11］。Kuhn 等［12］利用 RNA 干擾技術(shù)敲除 ADAM10，發(fā)現(xiàn)不同細(xì)胞中的α分泌酶裂解均受到完全抑制;APP裂解碎片的質(zhì)譜檢測結(jié)果也表明，ADAM10是組成α分泌酶的主要生理性成員。

2.1.3 ADAM17 ADAM17又稱為腫瘤壞死因子 α-轉(zhuǎn)化酶(tumour necrosis factor-α-converting enzyme，TACE)。研究發(fā)現(xiàn)，ADAM17被抑制或敲除的細(xì)胞，α-APPs減少，雖然α分泌酶仍存在較低的活性，但已不能被佛波酯所激活。研究表明［13］，雌激素可以通過直接調(diào)控分泌酶中ADAM17和PS-1的基因表達(dá)，影響APP的加工處理過程。另外，乙肼裂解酶(nardilysin)作為一種N-精氨酸二元轉(zhuǎn)化酶，能通過激活A(yù)DAM17影響α分泌酶的活性，進(jìn)而增強(qiáng)肝素結(jié)合表皮生長因子樣的胞外脫落［14］。

2.2 β分泌酶 β分泌酶是Aβ形成的限速酶，在Aβ的產(chǎn)生中起著決定性作用［15］。β位淀粉樣前體蛋白裂解酶(βsite APP cleaving enzyme，BACE)是一種跨膜天冬氨酰蛋白酶，包括BACE1和BACE2兩種類型?；蛱蕹龑?shí)驗(yàn)證實(shí)BACE1具備β分泌酶所必須的特性，是體內(nèi)主要的β分泌酶。

分別取AD腦皮質(zhì)內(nèi)BACE1和BACE2的樣品作比較，發(fā)現(xiàn)僅BACE1蛋白及其活性與Aβ呈正相關(guān);BACE2在AD腦內(nèi)有選擇性部位的增加，主要在星形膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)較多［16］。這些結(jié)果表明，在腦內(nèi)及其他易產(chǎn)生Aβ的細(xì)胞內(nèi)，BACE2 mRNA表達(dá)水平不如BACE1 mRNA高，且BACE1比BACE2更有效地剪切APP。但BACE2和BACE1可以相互拮抗，共同調(diào)節(jié)Aβ的生成，其作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

目前，在減少Aβ產(chǎn)生的眾多方法中，最便捷的就是通過直接抑制BACE來減少Aβ的生成。因此，BACE已成為設(shè)計(jì)AD治療藥物的重要靶點(diǎn)［17］。BACE基因表達(dá)的影響因素較為復(fù)雜。通過AlCl3誘導(dǎo)分化的人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SHSY5Y細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)，證實(shí)鋁毒性可輕微上調(diào) BACE1和BACE2基因表達(dá)水平［18］。Thomas等［19］發(fā)現(xiàn)兩種單克隆抗體2B3和2B12可以識別APP的β分泌酶裂解位點(diǎn)，通過空間阻斷β分泌酶降低Aβ的產(chǎn)生，對可溶性的sAPPα沒有影響，其中2B3對APP的親和力要強(qiáng)于2B12。提示抗裂解位點(diǎn)IgGs可能會是一種新的AD替代療法。β分泌酶抑制劑GRL-8234注射后能夠降低Tg2576轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)可溶性Aβ含量，進(jìn)而緩解年齡相關(guān)的認(rèn)知功能減退［20］。

2.2.1 BACE1 BACE1是一種壓力誘導(dǎo)蛋白酶，主要調(diào)控5'-非編碼區(qū)、小分子RNA和非編碼反義RNA的后轉(zhuǎn)錄，其表達(dá)在缺氧、局部缺血、炎癥及外傷環(huán)境下均有所增加［21］。BACE1基因啟動(dòng)子包含多種結(jié)合位點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄因子，包括核因子-κB、反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)、缺氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)、熱休克因子-1、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活子-1(STAT1)等［22］。

在AD發(fā)病過程中，激活的小膠質(zhì)細(xì)胞(microglia，MG)通過增加BACE1分泌影響Aβ的產(chǎn)生。非甾體類抗炎藥(non-steroid anti-inflammatory drugs，NSAIDS)可以通過抑制MG引發(fā)的神經(jīng)炎癥，進(jìn)而抑制BACE1的表達(dá)和Aβ的生成。國內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素能夠抑制AD相關(guān)基因APPmRNA表達(dá);其中，通過抑制APP的限速酶BACE1 mRNA和蛋白表達(dá)，進(jìn)一步抑制 APP分解產(chǎn)物 C99的蛋白表達(dá)和Aβ40/42的產(chǎn)生［23］。提示姜黃素可以作為一種抗炎藥物應(yīng)用于AD的治療，并且與NSAIDs相比較，具有毒副作用小的特點(diǎn)。

SNX-6(sorting nexin 6)是一種最新發(fā)現(xiàn)的與BACE1相關(guān)的囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。RNA干擾技術(shù)敲除SNX-6，發(fā)現(xiàn)sAPPβ和β-CTF水平升高進(jìn)而增加Aβ的產(chǎn)生;而SNX-6減少又可提高BACE1水平的穩(wěn)態(tài)，增加退化的BACE1從核內(nèi)體向反面高爾基體管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)運(yùn)［24］。這說明SNX-6能夠調(diào)節(jié)BACE1基底水平及其退化轉(zhuǎn)運(yùn)，進(jìn)而調(diào)節(jié)BACE1和Aβ的形成。

Aβ可以刺激BACE1轉(zhuǎn)錄和減少其正反饋，進(jìn)而增加APP β-裂解酶和Aβ積聚，形成一種惡性循環(huán)的過程。應(yīng)用APP專屬酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)方法測定AD腦內(nèi)皮質(zhì)sAPP β水平，發(fā)現(xiàn)對于遲發(fā)型AD患者Aβ的處理過程，要從腦內(nèi)皮質(zhì)sAPP β和BACE1活性等多方面去分析［25］。甘草屬植物洋甘草中提取出的天然產(chǎn)物 2，2'，4'-Trihydroxychalcone(TDC)，是一種非競爭性的BACE1專屬抑制劑，能夠有效抑制人類胚胎腎細(xì)胞中APP的β裂解和Aβ的產(chǎn)生;并且發(fā)現(xiàn)通過每天給予APP-PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠TDC 9 mg·kg－1，Morris水迷宮試驗(yàn)結(jié)果顯示能夠明顯改善其學(xué)習(xí)記憶能力［26］。

近年來，RNA干擾技術(shù)在靶向BACE治療老年性癡呆中的應(yīng)用，越來越受到人們的關(guān)注和期待［27］。β裂解酶特異性小干擾RNA慢病毒基因載體能夠降低BACE1表達(dá)水平，Singer等［28］研究發(fā)現(xiàn)，β裂解酶特異性小干擾RNA可以明顯抑制APP轉(zhuǎn)基因老鼠體內(nèi)APP裂解，減輕其神經(jīng)退變及行為缺陷，提示這種方法對于AD的治療具有潛在的價(jià)值。

通過選用攜帶β分泌酶底物肽(BACEsp)基因的重組病毒pLXSN-BACEsp(pBV)，作用于經(jīng)APP轉(zhuǎn)染SK-N-SH細(xì)胞建立的AD細(xì)胞模型，結(jié)果顯示pBV預(yù)處理組細(xì)胞的活性、胞內(nèi)APP的表達(dá)量明顯高于AD模型組和pBV后處理組，說明BACEsp對由APP所造成的AD細(xì)胞模型的神經(jīng)毒性具有明顯保護(hù)作用［29］。此外，基于配體計(jì)算方法篩選出的特定藥效團(tuán)Hypo-1，推斷其可能是目前最好的特定藥效團(tuán)模型之一，可以應(yīng)用于新型BACE1分泌酶抑制劑的設(shè)計(jì)研究［30］。

2.2.2 BACE2 BACE2在Aβ產(chǎn)生過程中的功能是備受爭議的。BACE2和BACE1具有相同的氨基酸序列，是55%同源的BACE1，在心血管組織中表達(dá)較高。盡管BACE2在腦內(nèi)也有所表達(dá)，但其與AD潛在的聯(lián)系卻不得而知。BACE2體內(nèi)試驗(yàn)尚未證明其功能，Azkona等［31］利用APP轉(zhuǎn)基因大鼠模型證明，BACE2與淀粉樣通路、認(rèn)知功能減退或膽堿能功能退化等無關(guān)。

但BACE2過表達(dá)卻會出現(xiàn)另外一種現(xiàn)象，即Tg BACE2動(dòng)物多表現(xiàn)出明顯的焦慮行為，并伴有藍(lán)斑核腎上腺素能神經(jīng)元數(shù)目增加。BACE2和APP的雙重過表達(dá)并不增加BACE2/APP雙轉(zhuǎn)基因大鼠腦內(nèi)Aβ的積聚，但可能對轉(zhuǎn)基因大鼠的特殊行為和認(rèn)知區(qū)域有積極作用［32］。這些結(jié)果表明，BACE2不直接參與老年斑的形成，但能通過激活下游α分泌酶裂解位點(diǎn)來參與Aβ產(chǎn)生，具體作用機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究。

2.3 γ分泌酶 γ分泌酶是Aβ產(chǎn)生所必需的另一種關(guān)鍵酶，其作用位點(diǎn)對于長Aβ片段的產(chǎn)生及AD的病理過程影響較大。γ分泌酶活性是由早老蛋白(presenilins，PS)、Aph1、Pen2和Nicastrin蛋白(NCT)所組成的多蛋白復(fù)合體來介導(dǎo)的，主要影響APP的裂解，釋放Aβ形成AD特征性的淀粉樣斑塊。

γ分泌酶同樣可以裂解Notch蛋白、N-鈣黏著蛋白和其他重要的信號分子。但臨床所需的有效γ分泌酶抑制劑是既能減少Aβ積聚，又不會影響其他的γ分泌酶底物，尤其是Notch蛋白［33］。研究發(fā)現(xiàn)，γ分泌酶復(fù)合體(γ-secretase complex)在AD發(fā)病機(jī)制中起重要作用。Aph1蛋白通過影響原位上有催化作用的PS1亞基的構(gòu)型，調(diào)節(jié)γ分泌酶復(fù)合體的水解活性，特異性抑制Aph1B復(fù)合物的活性，能夠明顯改善小鼠AD模型的臨床表現(xiàn)而無Notch相關(guān)副作用。而且在Aph1BC－/－小鼠AD模型腦內(nèi)淀粉樣病理變化明顯降低，學(xué)習(xí)記憶行為學(xué)指標(biāo)明顯改善［34］，說明Aph1B復(fù)合物能夠決定人腦中全部γ分泌酶的活性。因此，設(shè)計(jì)針對Aph1B的γ分泌酶復(fù)合體的藥物，在AD治療過程中可能獲得高效低毒的結(jié)果。

司馬西特(semagacestat)是美國禮來公司研發(fā)的一種新型γ分泌酶抑制劑，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)semagacestat能夠明顯降低血漿、腦脊液中的Aβ水平。Ⅱ期臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示［35］，semagacestat有可能成為延緩AD患者認(rèn)知功能減退的有效藥物。目前，semagacestat正在進(jìn)行Ⅲ期臨床試驗(yàn)，預(yù)計(jì)到2012年才能完成，有望用于輕中度AD的治療。

以往研究，對于淀粉樣前體蛋白－羧基末端碎片(APPCTF)中γ裂解和ε裂解還存在爭議，但也有觀點(diǎn)支持APPCTF的連續(xù)裂解［36］。He等［37］發(fā)現(xiàn)一種新型 γ分泌酶激活蛋白(gSAP)，它也是APP-CTF，并可以通過γ分泌酶及其底物的相互作用選擇性增加Aβ的產(chǎn)生。其中，gSAP既不與Notch作用，也不影響其裂解;體外重組gSAP能夠刺激Aβ的產(chǎn)生，降低gSAP能夠減少細(xì)胞株中Aβ的水平。此外，AD大鼠模型敲除gSAP能夠減少Aβ和老年斑的產(chǎn)生。

另一種新的噻吩磺胺類γ分泌酶抑制劑GSI-953(begacestat)，可以選擇性抑制γ分泌酶，也不影響Notch蛋白，并且還能夠增強(qiáng)γ分泌酶復(fù)合體作用［38］。此外，兩種選擇性γ分泌酶抑制劑ELN318463和ELN475516，在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中對抑制Aβ的產(chǎn)生要比對Notch信號的影響強(qiáng)度大75～120倍。表明ELN318463和ELN475516能夠選擇性抑制γ分泌酶，并不影響Notch等其他底物，值得進(jìn)一步開發(fā)研究［39］。

δ阿片受體(delta-opioid receptor，DOR)是一種G-蛋白耦合受體，活化后能夠增強(qiáng)γ分泌酶的活性、促進(jìn)Aβ的產(chǎn)生。最近有報(bào)道稱DOR是一種BACE1和γ分泌酶組成的復(fù)合體。DOR活化可以促進(jìn)這種復(fù)合體的內(nèi)吞作用，進(jìn)而增加BACE1和γ分泌酶的活性，最終增加Aβ的產(chǎn)生。AD小鼠使用DOR拮抗劑納曲吲哚(naltrindole)或敲除DOR進(jìn)行的慢性治療能夠降低BACE1和γ分泌酶的活性，減輕其Aβ病理特征和改善其空間學(xué)習(xí)及記憶能力［40］。

Farfara等［41］首次證明 γ分泌酶在AD中具有雙重作用。一種作用是裂解APP產(chǎn)生Aβ，另一種是調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞以清除Aβ的積聚及其神經(jīng)毒性。研究表明，PS是γ分泌酶亞族的催化劑［42］，PS-1與PS-2能夠減少小膠質(zhì)細(xì)胞活性，二者和γ分泌酶抑制劑一樣能夠抑制小膠質(zhì)細(xì)胞基因表達(dá)、蛋白水平和遷移能力，這些變化也會降低可溶性Aβ的吞噬作用。這也提示我們γ分泌酶介導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞通路可能是未來治療AD的研究途徑之一。

3 結(jié)語

綜上所述，以APP分泌酶為靶點(diǎn)，選擇性地激活α分泌酶或抑制β和γ分泌酶能夠有效地減少Aβ的產(chǎn)生。深入研究分泌酶和AD的關(guān)系，將有助于揭示AD的發(fā)病機(jī)制。然而，分泌酶的影響因素較為復(fù)雜，具體作用位點(diǎn)和機(jī)制仍未明確。深入研究APP的代謝調(diào)控路徑，仍然是一項(xiàng)迫切需要解決的課題。

在今后的研究工作中，一方面，針對一些APP分泌酶干預(yù)藥物的不良反應(yīng)進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，或者研發(fā)新的劑型，將是該類抗AD藥物研發(fā)的重點(diǎn)之一;另一方面，以APP分泌酶為靶點(diǎn)，根據(jù)其表面的某些特異性受體研發(fā)相應(yīng)的受體激動(dòng)劑或抑制劑，可能為臨床防治AD提供新的方法與選擇。

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