沈 耀，張晨輝，胡薇薇，陳 忠

(1.溫州醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，浙江溫州325035;2.浙江大學(xué)藥學(xué)院，浙江杭州310058)

3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)還原法是一種簡(jiǎn)單、靈敏、經(jīng)濟(jì)的體外檢測(cè)細(xì)胞活性和增殖的方法［1-2］。其檢測(cè)原理為:活細(xì)胞線(xiàn)粒體或非線(xiàn)粒體中的琥珀酸脫氫酶等能使外源性MTT還原為水不溶性的紫黑色結(jié)晶物——甲瓚(formazan)，并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞則無(wú)此功能［3］。二甲基亞砜(DMSO)能溶解細(xì)胞中的甲瓚，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其光吸收值，可反映活細(xì)胞數(shù)量。許多文獻(xiàn)顯示在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比;使用MTT方法得到的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和使用其它方法所得數(shù)據(jù)一致性較高［4-5］。目前，該方法已被廣泛應(yīng)用于抗腫瘤藥物的大規(guī)模篩選、腫瘤放射敏感性檢測(cè)、細(xì)胞毒性試驗(yàn)、細(xì)胞增殖和新材料的生物兼容性以及生物活性因子的活性檢測(cè)等。

然而，MTT還原法的一些缺點(diǎn)致使實(shí)驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)偏差。一些胞外物質(zhì)，如抗壞血酸、維生素E和N-乙酰半胱氨酸以及一些植物提取物等，能夠在無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)中還原MTT產(chǎn)生甲瓚［6］。此外，MTT還原法還受細(xì)胞培養(yǎng)液的pH及含糖量等的影響［7］?？梢?jiàn)，在MTT還原法應(yīng)用時(shí)，應(yīng)排除這些潛在的干擾因素，從而得到準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。有機(jī)胺類(lèi)藥物，如苯海拉明等在離體細(xì)胞實(shí)驗(yàn)上運(yùn)用的較多，而MTT還原法也經(jīng)常被用來(lái)檢測(cè)這些藥物處理后細(xì)胞的活性變化及增殖等情況。因此，本實(shí)驗(yàn)將探討苯海拉明等有機(jī)胺類(lèi)藥物對(duì)MTT還原法測(cè)定細(xì)胞活性準(zhǔn)確性的影響。結(jié)果顯示，高濃度苯海拉明等有機(jī)胺類(lèi)藥物可通過(guò)抑制甲瓚的外排而促進(jìn) MTT還原生成甲瓚，從而干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)藥品和化學(xué)試劑 MTT購(gòu)自生工生物工程(上海)有限公司。苯海拉明(diphenhydramine)、吡拉明(pyrilamine)、西米替丁(cimetidine)、卓蘭替丁(zolantidine)、組胺(histamine)、hoechst 33342、propidium iodide(PI)、多聚賴(lài)氨酸、阿糖胞苷購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。L-谷氨酰胺、胰酶、DMEM高糖培養(yǎng)基、馬血清、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。

1.2 皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng) 參照文獻(xiàn)報(bào)道［8］，在無(wú)菌條件下取出新生24 h內(nèi)的SD大鼠的全腦，小心分離左右半腦，剔除嗅球、紋狀體、海馬和基底腦組織，將皮層組織移入另一只含有冰冷解剖液的培養(yǎng)皿中，除去軟腦膜和血管。用手術(shù)刀片將皮層組織搗碎，用0.25%胰酶置于培養(yǎng)皿中，在37℃下消化15～20 min。然后加入適量培養(yǎng)液，用吸管吹打成細(xì)胞懸液，接種到經(jīng)0.1%多聚賴(lài)氨酸包被的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。24 h后更換培養(yǎng)液，以后每2～3 d更換一次培養(yǎng)液。培養(yǎng)10～12 d后，待培養(yǎng)瓶中細(xì)胞鋪滿(mǎn)瓶底時(shí)，換新鮮培養(yǎng)液置于培養(yǎng)箱內(nèi)2～3 h，隨后將培養(yǎng)瓶置于37℃恒溫?fù)u床上，以260 r/min的速度振搖過(guò)夜，以去除混雜的神經(jīng)元細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞。次日，用PBS液洗滌細(xì)胞數(shù)次，用0.25%胰酶消化細(xì)胞成細(xì)胞懸液，按1×105cells/ml密度將細(xì)胞接種至培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板或玻片，2～3 d后用于實(shí)驗(yàn)。免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示，按此種方法獲得的膠質(zhì)細(xì)胞GFAP陽(yáng)性率＞95%。

1.3 藥物處理 星形膠質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)至適宜密度后，加入苯海拉明、吡拉明、西米替丁，使其終濃度分別為 10-7、10-6、10-5、10-4、10-3mol/L;加入組胺、卓蘭替丁，使其終濃度分別為10-8、10-7、10-6、10-5、10-4mol/L，藥物分別作用 24 h，而后觀察其對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞MTT還原的影響。在其它實(shí)驗(yàn)中采用苯海拉明(10-4mol/L)作用24 h。在各個(gè)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行時(shí)都安排有平行對(duì)照組。

1.4 MTT檢測(cè)法 參照文獻(xiàn)報(bào)道［9］，藥物處理完畢后，96孔板細(xì)胞每孔加入10 μl MTT(5 mg/ml溶于 PBS)，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱孵育2 h，棄去培養(yǎng)基，加入二甲亞砜(DMSO)，振蕩10 min左右，待結(jié)晶完全溶解后，在酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)490 nm處吸光值(OD490)。以正常對(duì)照組所測(cè)的MTT吸光值為基數(shù)100%，藥物處理組與正常對(duì)照組的比值百分比來(lái)計(jì)算藥物對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞MTT還原的影響。為了觀察MTT還原產(chǎn)生的甲瓚在星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的分布，培養(yǎng)在玻片上的細(xì)胞在藥物和MTT處理完后在光學(xué)顯微鏡(Olympus)下觀察、拍照。MTT孵育一段時(shí)間后，針狀晶體有時(shí)候出現(xiàn)在細(xì)胞的表面，它們被認(rèn)為是細(xì)胞通過(guò)胞吐作用排出的甲瓚。

1.5 細(xì)胞核熒光染色 為了探索苯海拉明對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖及活性的作用，我們采用了Hoechst 33342和 PI核熒光雙染的方法。Hoechst 33342具有高度的脂溶性，可穿透細(xì)胞膜，所以很容易進(jìn)入活細(xì)胞以及凋亡的細(xì)胞。PI只能進(jìn)入細(xì)胞膜有破損的細(xì)胞內(nèi)，所以只有壞死的細(xì)胞才有PI陽(yáng)性反應(yīng)。Hoechst 33342和PI用蒸餾水分別配成1 mg/ml的濃度加以貯存，藥物處理完后在培養(yǎng)的細(xì)胞中加入Hoechst 33342 溶液，使其終濃度為 10 μg/ml，37℃孵育10 min。然后加入PI染液，使其終濃度為 10 μg/ml，4℃，10 min。用 PBS 洗一次，4%多聚甲醛固定，熒光顯微鏡觀察(PI熒光為紅色，620 nm;Hoechst 33342熒光為藍(lán)色，480 nm)。每個(gè)玻片上隨機(jī)選取6個(gè)視野，拍照，然后細(xì)胞計(jì)數(shù)，分別計(jì)算細(xì)胞密度(反映細(xì)胞增殖情況)和細(xì)胞的凋亡及壞死率。

2 結(jié)果

2.1 苯海拉明等有機(jī)胺類(lèi)藥物對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞MTT還原法的影響 如圖1所示，苯海拉明、吡拉明在 10-7、10-6、10-5mol/L，卓蘭替丁在 10-8、10-7、10-6mol/L 濃度時(shí)，對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞還原MTT為甲瓚的能力沒(méi)有影響;當(dāng)苯海拉明、吡拉明濃度為10-4mol/L，卓蘭替丁濃度為10-5mol/L時(shí)，能顯著提高星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的甲瓚量;然而當(dāng)苯海拉明、吡拉明濃度達(dá)到10-3mol/L，卓蘭替丁濃度達(dá)到10-4mol/L時(shí)，MTT還原為甲瓚的量顯著下降，此時(shí)光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生嚴(yán)重死亡。組胺(10-8～10-4mol/L)和西米替丁(10-7～10-3mol/L)對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)MTT還原為甲瓚的量沒(méi)有影響。

圖1 組胺、苯海拉明、吡拉明、卓蘭替丁、西米替丁對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞MTT甲瓚生成的影響Fig.1 Effects of histamine， diphenhydramine， pyrilamine， zolantidine and cimetidine on MTT formazan formation in astrocytes

2.2 苯海拉明對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖及活性的影響 MTT還原為甲瓚的量與細(xì)胞的活性和數(shù)量密切相關(guān)，于是我們又采用了 Hoechst 33342和PI核熒光雙染的方法，來(lái)觀察苯海拉明對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞增值和活性的影響。苯海拉明(10-4mol/L)對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖沒(méi)有影響［對(duì)照組細(xì)胞密度為:(2 231±144)個(gè)/mm2;苯海拉明處理組細(xì)胞密度為:(2 145±115)個(gè)/mm2，P ＞ 0.05］，見(jiàn)圖2a。另一方面，從Hoechst 33342和PI染凋亡和壞死細(xì)胞的結(jié)果看，苯海拉明(10-4mol/L)孵育24 h，對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡和壞死均沒(méi)有顯著影響［對(duì)照組細(xì)胞凋亡率:(3.54±0.59)%，苯海拉明處理組細(xì)胞凋亡率:(4.1±0.89)%，P＞0.05;對(duì)照組細(xì)胞壞死率:(0.16±0.14)%，苯海拉明處理組細(xì)胞壞死率:(0.18±0.15)%，P＞0.05］，見(jiàn)圖2b。

圖2 苯海拉明對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖和壞死及凋亡的影響Fig.2 Effects ofdiphenhydramine on cell proliferation and necrosis and apoptosis in astrocytes

2.3 苯海拉明對(duì)MTT甲瓚的胞吐作用 MTT進(jìn)入細(xì)胞后被還原為甲瓚，先以甲瓚顆粒的形式沉積在細(xì)胞內(nèi)，隨著時(shí)間的推移甲瓚顆粒逐漸變黑、增大。一段時(shí)間后甲瓚顆粒逐漸移向細(xì)胞膜，進(jìn)而被排出胞外，這個(gè)過(guò)程被稱(chēng)為MTT甲瓚的胞吐作用［10］。在本實(shí)驗(yàn)中，MTT甲瓚的胞吐作用被高濃度苯海拉明所抑制。如圖3a所示，對(duì)照組星形膠質(zhì)細(xì)胞MTT孵育2 h后，絕大多數(shù)細(xì)胞周?chē)霈F(xiàn)針狀甲瓚晶體(箭頭所示)。然而苯海拉明(10-4mol/L)處理24 h，顯著抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)MTT甲瓚的胞吐作用，使甲瓚仍以顆粒狀態(tài)沉積于細(xì)胞內(nèi)(圖3b，箭頭所示)。吡拉明和卓蘭替丁均有抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)MTT甲瓚的胞吐作用(數(shù)據(jù)未顯示)。

2.4 pH對(duì)苯海拉明抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞甲瓚胞吐作用的影響 為了探索pH對(duì)苯海拉明抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞甲瓚胞吐作用的影響，在孵育苯海拉明前30 min，給細(xì)胞更換不同pH培養(yǎng)液，其它成分保持不變。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。正常培養(yǎng)液pH(7.2)條件下，苯海拉明抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)MTT甲瓚的外排，如前所述。酸性pH(6.4)條件下，苯海拉明顯著抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)MTT甲瓚的胞吐作用，致使胞內(nèi)甲瓚大量生成，生成量為對(duì)照組的136%。而偏堿性pH(8.0)條件下，苯海拉明對(duì)MTT甲瓚的胞吐作用沒(méi)有抑制作用，胞內(nèi)甲瓚的生成量為對(duì)照組的101.57%。

3 討論

細(xì)胞活性和增殖狀況的測(cè)定是評(píng)價(jià)藥物毒性，檢測(cè)各種生物活性因子的活性，構(gòu)建理想的細(xì)胞模型等過(guò)程不可或缺的步驟。MTT還原法是其中最為簡(jiǎn)單、迅速和高敏感性的檢測(cè)細(xì)胞活性與增殖的方法。然而，有些生物活性物質(zhì)或藥物本身就能干擾細(xì)胞內(nèi)MTT的代謝，因此，在檢測(cè)某些化學(xué)試劑或藥物的生物毒性作用或保護(hù)性作用時(shí)就要先排除此類(lèi)因素。

在本實(shí)驗(yàn)中，我們采用了苯海拉明、吡拉明、西米替丁、卓蘭替丁、組胺5種有機(jī)胺類(lèi)藥物。這5種胺類(lèi)藥物作用于星形膠質(zhì)細(xì)胞后，我們發(fā)現(xiàn)采用不同的細(xì)胞活性測(cè)定方法檢測(cè)出相互矛盾的結(jié)果。苯海拉明(10-4mol/L)、吡拉明(10-4mol/L)、卓蘭替丁(10-5mol/L)作用于星形膠質(zhì)細(xì)胞24h后，采用MTT還原法測(cè)定，結(jié)果顯示OD490值顯著上升，提示這個(gè)濃度的苯海拉明、吡拉明和卓蘭替丁能夠提高星形膠質(zhì)細(xì)胞的活性或者促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖。而Hoechst 33342和PI核熒光雙染方法顯示，苯海拉明(10-4mol/L)作用于星形膠質(zhì)細(xì)胞24 h并沒(méi)有促進(jìn)細(xì)胞的增殖，同時(shí)對(duì)細(xì)胞的凋亡和壞死也沒(méi)有影響。Abe等研究發(fā)現(xiàn)，淀粉樣物質(zhì)(β-amyloid peptide，βA)通過(guò)促進(jìn)MTT甲瓚的胞吐作用來(lái)抑制MTT在細(xì)胞內(nèi)的還原［11］。因此，我們也在顯微鏡下進(jìn)一步觀察苯海拉明等作用后MTT甲瓚在細(xì)胞內(nèi)的分布狀況，發(fā)現(xiàn)苯海拉明可以抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)MTT甲瓚的胞吐作用。MTT孵育2 h后，對(duì)照組星形膠質(zhì)細(xì)胞膜表面分布著大量針狀甲瓚晶體，而在苯海拉明處理組，MTT還原產(chǎn)生的甲瓚仍以顆粒狀沉積于細(xì)胞內(nèi)。MTT是一種不透膜的物質(zhì)，它通過(guò)胞吞作用進(jìn)入細(xì)胞［10］。當(dāng)甲瓚排出細(xì)胞后以針狀晶體形式附著于細(xì)胞膜上，阻止了細(xì)胞對(duì)胞外MTT的攝取作用，從而減少胞內(nèi)MTT的濃度，進(jìn)而減少甲瓚的生成。因此，我們推測(cè)苯海拉明是通過(guò)抑制甲瓚的外排來(lái)減少胞外的甲瓚晶體，使得更多的MTT通過(guò)胞吞作用進(jìn)入細(xì)胞，進(jìn)而產(chǎn)生更多的甲瓚。

圖3 苯海拉明抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)MTT甲瓚的胞吐作用Fig.3 Diphenhydramine suppresses MTT formazan exocytosis in astrocytes

圖4 pH對(duì)苯海拉明抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞甲瓚胞吐作用的影響Fig.4 EffectofpH on the inhibition of formazan exocytosis induced by diphenhydramine in astrocytes

在本實(shí)驗(yàn)中我們還發(fā)現(xiàn)，苯海拉明抑制甲瓚外排的作用與pH相關(guān)。當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)液的pH小于7.2時(shí)，苯海拉明抑制甲瓚的外排作用比較明顯;而當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)液的pH偏堿，如pH為8時(shí)，苯海拉明抑制甲瓚的外排作用消失。有文獻(xiàn)報(bào)道，甲瓚在細(xì)胞內(nèi)形成后主要在溶酶體內(nèi)積聚，然后被運(yùn)送到細(xì)胞膜周邊經(jīng)胞吐作用而排出［10］。而Morissette等發(fā)現(xiàn)，有機(jī)胺類(lèi)如普魯卡因胺、苯海拉明等在較高濃度時(shí)向溶酶體積聚而引起空泡的生成，而且這種作用與pH相關(guān)［12］。因此，我們推測(cè)偏酸性環(huán)境下更多的苯海拉明向溶酶體積聚，從而影響運(yùn)載有甲瓚的溶酶體向細(xì)胞膜的移動(dòng)以及胞吐過(guò)程。而在偏堿性環(huán)境下，苯海拉明向溶酶體內(nèi)積聚的作用減弱，從而使運(yùn)載有甲瓚的溶酶體能夠正常向細(xì)胞膜靠近并進(jìn)行胞吐。

總之，苯海拉明等一些有機(jī)胺類(lèi)藥物能夠影響星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)MTT甲瓚的胞吐作用，從而影響MTT還原法在檢測(cè)這類(lèi)藥物對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞活性及增殖作用的結(jié)果的準(zhǔn)確性。因此，使用有機(jī)胺類(lèi)藥物對(duì)細(xì)胞活性或增殖進(jìn)行研究時(shí)，應(yīng)謹(jǐn)慎選擇檢測(cè)方法。此外，使用MTT方法時(shí)也應(yīng)謹(jǐn)慎檢查反應(yīng)體系的各項(xiàng)潛在影響因素，使實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)能真實(shí)反應(yīng)事實(shí)。

［1］MORGAN D M.Tetrazolium(mtt)assay for cellular viability and activity［J］.Methods Mol Biol，1998，79:179-183.

［2］MOSMANN T.Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival:Application to proliferation and cytotoxicity assays ［J］.J Immunol Methods，1983，65:55-63.

［3］AHMAD S，AHMAD A，SCHNEIDER K B，et al.Cholesterol interferes with the mtt assay in human epithelial-like(a549)and endothelial(hlmve andhcae)cells［J］.Int J Toxicol，2006，25:17-23.

［4］SMITH M D，BARBENEL J C，COURTNEY J M，et al.Novel quantitative methods for the determination of biomaterial cytotoxicity［J］.Int J Artif Organs，1992，15:191-194.

［5］LOVELAND B E，JOHNS T G，MACKAY I R，et al.Validation of the mtt dye assay for enumeration of cells in proliferative and antiproliferative assays［J］.Biochem Int，1992，27:501-510.

［6］BRUGGISSER R，VON DAENIKEN K，JUNDT G，et al.Interference of plant extracts，phytoestrogens and antioxidants with the mtt tetrazolium assay［J］.Planta Med，2002，68:445-448.

［7］VISTICA D T，SKEHAN P，SCUDIERO D，et al.Tetrazolium-based assays for cellular viability:A critical examination of selected parameters affecting formazan production ［J］.Cancer Res，1991，51:2515-2520.

［8］SHEN Y，HE P，F(xiàn)AN Y Y，et al.Carnosine protects against permanent cerebral ischemia in histidine decarboxylase knockout mice by reducing glutamate excitotoxicity ［J］.Free Radic Biol Med，2010，48:727-735.

［9］SHEN Y，HU W W，F(xiàn)AN Y Y，et al.Carnosine protects againstnmda-induced neurotoxicity in differentiated rat pc12 cells through carnosinehistidine-histamine pathway and h(1)/h(3)receptors［J］.Biochem Pharmacol，2007，73:709-717.

［10］LIU Y，PETERSON D A，KIMURA H，et al.Mechanism of cellular 3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyltetrazolium bromide (mtt)reduction［J］.J Neurochem，1997，69:581-593.

［11］ABE K，SAITO H.Amyloid beta protein inhibits cellular mttreduction notby suppression of mitochondrialsuccinate dehydrogenase butby acceleration of mtt formazan exocytosis in cultured rat cortical astrocytes［J］.Neurosci Res，1998，31:295-305.

［12］MORISSETTE G，MOREAU E，R C G，et al.Massive cell vacuolization induced by organic amines such as procainamide［J］.J Pharmacol Exp Ther，2004，310:395-406.