金光明，樸蓮善，李 蘭

（延邊大學(xué)附屬醫(yī)院，吉林 延吉 133000）

糖尿病是由多種病因引起的以血糖升高為特征的代謝性疾病。隨著社會經(jīng)濟(jì)的發(fā)展及人們生活水平的提高，糖尿病的發(fā)病率呈逐年上升趨勢。據(jù)研究表明，糖尿病患者并發(fā)心血管疾病的系數(shù)比正常人高2～4倍[1]，頸總動脈內(nèi)-中膜厚度（IMT）是冠心病、腦血管疾病的預(yù)測因子，是糖尿病患者動脈硬化的定量臨床指標(biāo)[2-3]。目前，使用彩色多普勒超聲技術(shù)通過對頸總動脈IMT的測量以及頸總動脈壁粥樣硬化斑塊的檢測，是預(yù)測和定量評價頸總動脈疾病的重要手段。近年來發(fā)現(xiàn)NADPH氧化酶是活性氧ROS生成的關(guān)鍵部位，其中氧化酶p22phox亞基與酶活性相關(guān)，是NADPH氧化酶生成氧自由基的關(guān)鍵部位，而其中位于4號外顯子上的第242密碼子存在C-T基因突變，最終影響血管自由基的生成，成為心、腦血管病變的病因之一。本文主要研究2型糖尿病患者的頸總動脈IMT的改變與NADPH氧化酶p22phox亞基C242T基因多態(tài)性的聯(lián)系，以闡明C-T基因突變與2型糖尿病患者頸總動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，從而為臨床有效防治2型糖尿病患者大血管并發(fā)癥提供基因?qū)W方面的理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 研究對象

選取本院住院的T2DM患者273例，其中男128例，女145例，平均年齡（55.45±10.55）歲。T2DM診斷依據(jù)1999年WHO診斷標(biāo)準(zhǔn)。所有受檢對象均為無血緣關(guān)系個體。

1.1.2 儀器與檢查方法

使用Siemens Acuson X300彩色多普勒超聲診斷儀，探頭頻率5～7.5MHz。受檢者平臥位，肩部墊高，頸后仰，從鎖骨上窩逐漸上移并分別縱、橫切掃查，于頸總動脈分叉處后方2cm處，取后壁測定頸總動脈舒張期IMT，重復(fù)測量3次取平均值。檢查時宜輕，切勿加壓形成人為血管狹窄，注意雙側(cè)對比。正常人的頸總動脈IMT<1mm（圖1），以IMT≥1mm（圖2）作為頸總動脈IMT增厚標(biāo)準(zhǔn)，以內(nèi)膜局限性突出管腔厚度≥1.3mm（圖 3）為斑塊形成標(biāo)準(zhǔn)[4]。

圖1 正常厚度的頸總動脈內(nèi)-中膜的聲像圖。圖中所示右側(cè)頸總動脈內(nèi)-中膜厚度為0.4mm。圖2 頸總動脈內(nèi)-中膜增厚的聲像圖。圖中所示右側(cè)頸總動脈內(nèi)-中膜厚度為1.1mm，右側(cè)頸總動脈管腔內(nèi)徑為7.3mm。圖3 頸總動脈粥樣硬化斑塊形成的聲像圖。圖中所示右側(cè)頸總動脈內(nèi)-中膜局限性突出管腔厚度1.7mm，提示粥樣硬化斑塊形成。Figure 1.Normal thickness of the intima-media in right common carotid artery is 0.4mm.Figure 2.Thickness of the intima-media in right common carotid artery is 1.1mm,the right common carotid artery lumen diameter is 7.3mm.Figure 3.Protrusion of the intima-media into the lumen of right common carotid artery is 1.7mm,suggesting that the atherosclerotic plaque was formed.

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取

采用Promega公司生產(chǎn)的Wizard Genomic DNA Purification Kit提取DNA。取被檢測對象肘靜脈血3ml到加有EDTA-Na2抗凝劑的真空采血管中，并立刻顛倒混勻。取300μl血樣加入到1.5ml Eppendorf離心管中，按照細(xì)胞裂解、核裂解、RNA去除、沉淀蛋白質(zhì)、析出DNA、清洗DNA、水化DNA的過程分別加入試劑，進(jìn)行DNA的提取。最后將所得的DNA經(jīng)紫外分光光度計定量后于－70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 聚合酶鏈反應(yīng)

所設(shè)計引物為：上游引物：5，-TGC TTG TGG GTA AAC CAA GGC CGG TG-3’，下游引物：5，-AAC ACT GAG GTA AGT GGG GGT GGC TCC TGT-3’，由Promega公司合成。p22phox基因的PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系均為50μl，其中含10×PCR 緩沖液 5μl，2.5mmol/l dNTP 4μl，上、下游引物各 2μl，模板DNA 5μl，Taq DNA聚合酶0.6μl，不足體積用滅菌雙蒸水補(bǔ)足至50μl。置熱循環(huán)儀（TC-48/H型）中94℃預(yù)變性5min；再按下列程序循環(huán)35次，即94℃變性50s，59℃退火50s，72℃延伸 50min；末次循環(huán)后，72℃延伸 5min。

1.2.3 擴(kuò)增產(chǎn)物的限制性酶切

取 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 15μl， 用 1μl限制性內(nèi)切酶 RSA I（Promega公司）酶切NADPH氧化酶p22phox亞基242位點(diǎn)，37℃孵育4h，反應(yīng)終止后，消化片段在2.5%瓊脂糖凝膠上電泳，EB染色，染色后經(jīng)紫外燈判斷結(jié)果并拍照。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

用SPSS11.5軟件包進(jìn)行分析。將IMT正常與IMT增厚組、無斑塊組與有斑塊組的樣本含量進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，以消除差異?；蛐秃偷任换蝾l率采用基因直接計數(shù)法計算，各組間基因型及基因頻率比較采用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 NADPH氧化酶p22phox亞基基因型分析

NADPH氧化酶p22phox亞基基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小為348bp，根據(jù)限制性內(nèi)切酶RSA I酶切片段的情況，基因型有 3種，CC出現(xiàn) 348bp一條帶，CT出現(xiàn) 348bp、160bp、188bp三條帶，TT出現(xiàn)160bp、188bp兩條帶（圖4）。

圖4 NADPH氧化酶p22phox亞基242位點(diǎn)基因型。2.5%瓊脂糖凝膠電泳圖。M：DNA標(biāo)記物；1、2為TT基因型，3、4為CT基因型，5、6為CC基因型。Figure 4.NADPH oxidase subunit p22phox gene 242 genotype.Detected by DNA 2.5%agarose gel electrophoresis.M:DNA marker;1,2:TT genotype;3,4:CT genotype;5,6:CC genotype.

2.2 IMT正常組和IMT增厚組NADPH氧化酶p22phox亞基基因多態(tài)性的比較

NADPH氧化酶p22phox亞基基因242位點(diǎn)基因多態(tài)性在IMT正常組和IMT增厚組中的分布存在顯著性差異（χ2=10.788，P<0.05）；等位基因頻率在兩組人群中的分布也存在顯著性差異（χ2=3.846，P<0.05）（表 1）。

表1 2組患者p22phox242位點(diǎn)各基因型和等位基因頻率[例數(shù)（%）]

2.3 無斑塊組和有斑塊組NADPH氧化酶p22phox亞基基因多態(tài)性的比較

NADPH氧化酶p22phox亞基基因242位點(diǎn)基因多態(tài)性在無斑塊組和有斑塊組中的分布存在顯著性差異 （χ2=12.332，P<0.05）；等位基因頻率在兩組人群中的分布也存在顯著性差異（χ2=3.799，P<0.05）（表 2）。

表2 2組患者p22phox242各基因型和等位基因頻率[例數(shù)（%）]

3 討論

糖尿病在世界范圍內(nèi)已成為繼心腦血管疾病、腫瘤之后嚴(yán)重危害人類健康的第三大慢性病。在很多情況下，糖尿病的主要危害不是糖尿病本身，而是在糖尿病發(fā)展過程中出現(xiàn)的各種慢性并發(fā)癥。糖尿病引起的大血管病變可以導(dǎo)致動脈硬化、舒縮功能障礙及加重血管損傷后內(nèi)皮炎性反應(yīng)和血管平滑肌增殖等，造成冠心病等糖尿病性心血管疾病。雖然現(xiàn)代醫(yī)學(xué)技術(shù)已能有效地控制大多數(shù)患者的血糖，但仍無法有效地預(yù)防和治療糖尿病引發(fā)的慢性并發(fā)癥。由于糖尿病并發(fā)癥的高發(fā)性和嚴(yán)重性，糖尿病已經(jīng)成為世界第五大致死性疾病。

頸總動脈IMT是冠心病、腦血管疾病的預(yù)測因子，是糖尿病患者動脈硬化的定量臨床指標(biāo)。動脈粥樣硬化的危險因素年齡、高血糖、血脂異常、吸煙、高血壓等只能解釋頸總動脈IMT增厚的少部分，大部分與基因多態(tài)性、氧化應(yīng)激、纖溶系統(tǒng)異常、炎癥反應(yīng)等有關(guān)。

NADPH氧化酶p22phox亞基是血管內(nèi)皮活性氧ROS的主要發(fā)源地[5]，Ceriello等[6]又曾提出氧化應(yīng)激參與糖尿病發(fā)病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。NADPH氧化酶是細(xì)胞膜上一類特殊的電子傳遞復(fù)合物，是由 p40phox，p47phox，p67phox，細(xì)胞色素 b558（p22phox,gp91phox）五個主要基構(gòu)成[7]。細(xì)胞色素b558是NADPH的主要成分，由一條重鏈和一條輕鏈兩個亞基組成。其中重鏈為91KD糖蛋白（gp91phox），輕鏈為22KD多肽（p22phox），前者是NADPH氧化酶核心部分，后者則與酶活性相關(guān)，是NADPH氧化酶生成氧自由基的關(guān)鍵部位[8]，其編碼基因CYBA位于染色體16q24上。CYBA基因有四個多態(tài)性，即 C242T、G508A、C549T、A640G，而其中位于 4 號外顯子上的第242密碼子存在C-T基因突變，使得編碼的72號氨基酸的組氨酸變?yōu)槔野彼?，即產(chǎn)生一個RSA I酶切位點(diǎn)。它影響NADPH氧化酶的活性，引起氧化修飾的低密度脂蛋白（O-XLDL）生成，O-XLDL可抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞，O-XLDL受體和清道夫受體結(jié)合，引起細(xì)胞凋亡，還可抑制一氧化氮合成酶，引起一氧化氮合成下降，使血管收縮，血小板聚集，血栓形成，成為心、腦血管病因之一[9]。組氨酸變?yōu)槔野彼?，這一位點(diǎn)被認(rèn)為是p22pho亞基結(jié)合血紅蛋白的部位，而血紅蛋白也是體內(nèi)參與超氧陰離子生成重要部分，每分子氧合血紅蛋白分解釋放一個超氧陰離子，因而這種突變也間接影響了血管內(nèi)皮活性氧ROS產(chǎn)生。

觀察IMT的增厚及斑塊是否形成，目前最為常用的一種無創(chuàng)性檢查就是彩色多普勒超聲檢查技術(shù)。它對于評價病變程度，對并發(fā)癥的早期發(fā)現(xiàn)、早期治療及預(yù)后具有重要價值?，F(xiàn)階段國內(nèi)外學(xué)者對NADPH氧化酶p22phox亞基C242T基因多態(tài)性的研究多限于心、腦血管及糖尿病腎病領(lǐng)域，而從分子生物學(xué)角度研究有關(guān)基因多態(tài)性與頸總動脈IMT以及頸總動脈壁粥樣硬化斑塊的關(guān)系的研究在國內(nèi)極其稀少。本文意在從基因水平研究NADPH氧化酶p22phox亞基C242T基因多態(tài)性與IMT的增厚，斑塊形成的關(guān)系，從而為預(yù)測T2DM患者頸總動脈壁粥樣硬化斑塊的的發(fā)生及形成提供分子生物學(xué)方面的途徑及新的理論依據(jù)。

[1]Huang ES,Meigs JB,Singer DE.The effect of interventions to prevent cardiovascular disease in patients with type 2 diabetes mellitus[J].Am J Med,2001,111:633-642.

[2]Yamasaki Y,Kawamori R,Matsushima H,et al.Asymptomatic hyperglycaemia is associated with increased intimal plus medial thickness of the carotid artery[J].Diabetologia,1995,38:585-591.

[3]Kawamori R.Asymptomatic hyperglycaemia and early atherosclerotic changes[J].Diabetes Res Clin Pract,1998,40(Suppl):S35-S42.

[4]計竹梅，趙小平，范平.超聲測量頸總動脈內(nèi)膜中層膜厚度與頸總動脈斑塊的關(guān)系[J]. 中國動脈硬化雜志，2000，8（2）：165.

[5]Hong YR,Han L,Huang J,et al.Elimination of false negative results in the two-hybrid system in the phagocyte NADPH oxidase[J].Kaohsiung J Med Sci,1996,12(5):301-305.

[6]Ceriello A,Motz E.Is oxidative stress the pathogenic mechanism underlying insulin resistance,diabetes and cardiovascular disease.The common soil hypothesis revisited[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2004,24:816-823.

[7]姬仲，陸兵勛，王曉藝，等.廣東漢族人細(xì)胞色素C242T p22phox基因多態(tài)性觀察[J]. 第一軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2003，23（4）：387-388.

[8]Inoue N,Kawashima S,Kanazawa K.Polymorphism of the NADH/NADPH oxidase p22phox gene in patients with coronary artery disease[J].Circulation,1998,97(2):135-137.

[9]郭志剛，沈劍剛，翁昌鴻，等.冠心病、高血壓病人血漿氧自由基、一氧化氮及纖溶活性的變化[J].第一軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2001，19（2）：124-125.