侯 澍 張 磊 李紅杰 胡林森 (首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，北京 0008)

NGF誘導(dǎo)PC12細(xì)胞分化晚期的蛋白質(zhì)組學(xué)研究

侯 澍 張 磊1李紅杰2胡林森3(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，北京 100038)

目的 研究神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)誘導(dǎo)PC12細(xì)胞分化晚期的細(xì)胞蛋白質(zhì)組變化，探索NGF誘導(dǎo)細(xì)胞分化的分子機(jī)制。方法50 ng/m l NGF作用于PC12細(xì)胞96 h，提取細(xì)胞總蛋白，應(yīng)用熒光差異凝膠電泳(DIGE)獲取蛋白點(diǎn)的差異表達(dá)信息，運(yùn)用MALDI-TOF質(zhì)譜鑒定出差異蛋白質(zhì)。結(jié)果 NGF誘導(dǎo)96 h后，共有58個(gè)蛋白點(diǎn)發(fā)生變化，質(zhì)譜鑒定出了10種蛋白。結(jié)論 本實(shí)驗(yàn)首次應(yīng)用DIGE技術(shù)篩選NGF誘導(dǎo)PC12細(xì)胞分化晚期的相關(guān)蛋白，其中5種蛋白是首次在NGF誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞中被報(bào)道。這些蛋白可能是NGF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程的新成員，也可以成為藥物治療的新靶點(diǎn)。

蛋白質(zhì)組學(xué);DIGE;NGF;PC12細(xì)胞

神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)是最早被發(fā)現(xiàn)和分離純化的多肽生長(zhǎng)因子，是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(NT)家族的典型代表。本研究應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選NGF誘發(fā)PC12細(xì)胞分化的相關(guān)蛋白，旨在尋找NGF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程的新成員，為深入進(jìn)行神經(jīng)保護(hù)藥物的研發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 PC12細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)，DMEM購(gòu)自Gibco公司，NGF購(gòu)自廈門(mén)北大之路生物工程有限公司。尿素、硫脲、CyDye熒光標(biāo)記物(Cy2，Cy3，Cy5)、賴(lài)氨酸、24 cm固相pH梯度干膠條pH3-10NL、甘油、SDS、IAA等均購(gòu)自GE Healthcare-Biosciences公司。Ultrospec 3300 pro分光光度計(jì)、Ettan DALT Six電泳系統(tǒng)、Typhoon 9400系列多功能激光掃描成像系統(tǒng)以及基質(zhì)輔助激光解析/電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOFMS)均由GE Healthcare-Biosciences公司提供。

1.2 NGF誘導(dǎo)PC12細(xì)胞分化晚期模型的建立 DMEM培養(yǎng)基中含體積分?jǐn)?shù)為10%新生牛血清、1%谷氨酰胺、100μg/ml青霉素、100μg/m l鏈霉素，PC12細(xì)胞于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)至90%接觸時(shí)進(jìn)行傳代，選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。

將細(xì)胞按1×105個(gè)/ml密度接種，實(shí)驗(yàn)組中加入50 ng/ml NGF、對(duì)照組中加入等體積培養(yǎng)液。給藥后96 h進(jìn)行吖啶橙和溴化乙啶染色，觀察細(xì)胞形態(tài)變化，并計(jì)數(shù)分化的細(xì)胞(每孔隨機(jī)計(jì)數(shù)300個(gè)細(xì)胞，其中突起的長(zhǎng)度超過(guò)胞體直徑2倍者計(jì)為陽(yáng)性，長(zhǎng)出多個(gè)突起的細(xì)胞只計(jì)數(shù)1次，至少計(jì)數(shù)3個(gè)孔)。

1.3 蛋白質(zhì)組學(xué)分析和差異蛋白質(zhì)的鑒定 選取四批不同代數(shù)的細(xì)胞，設(shè)為實(shí)驗(yàn)組(T1～4)和對(duì)照組(C1～4)，實(shí)驗(yàn)組中加入50 ng/m l NGF、對(duì)照組中加入等體積培養(yǎng)液，再培養(yǎng)96 h。收取細(xì)胞蛋白質(zhì)，純化后定量。T1～4、C1～4各取50μg分別放入8個(gè)離心管中;再取T1～4、C1～4各25μg制成內(nèi)標(biāo)。如表1所示進(jìn)行分組，分別以1μl CyDye(Cy3、5)工作液標(biāo)記相應(yīng)的蛋白樣品，用4μl Cy2工作液標(biāo)記內(nèi)標(biāo)。分組后，按既定程序進(jìn)行雙向電泳，然后進(jìn)行凝膠圖像掃描與分析。

表1 樣品分組及內(nèi)標(biāo)構(gòu)成

同樣的方法進(jìn)行制備膠的電泳，然后應(yīng)用考馬斯亮藍(lán)染色及MALDI-TOF-MS質(zhì)譜儀進(jìn)行蛋白質(zhì)的鑒定。

2 結(jié)果

2.1 NGF作用96 h PC12細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化 見(jiàn)圖1。NGF作用后觀察PC12細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化，并與對(duì)照組進(jìn)行比較。NGF作用96 h后，細(xì)胞變得扁平，呈梭形或多角形，胞體增大，48%的細(xì)胞長(zhǎng)出長(zhǎng)突起，不同細(xì)胞的突起可連接成網(wǎng)。顯微鏡下細(xì)胞計(jì)數(shù)，NGF作用96 h后實(shí)驗(yàn)組陽(yáng)性細(xì)胞約占細(xì)胞總數(shù)的48%，相應(yīng)對(duì)照組陽(yáng)性細(xì)胞約占2.4%。

圖1 對(duì)照組與NGF處理組PC12細(xì)胞的形態(tài)(吖啶橙和溴化乙啶染色，×200)

2.2 NGF誘導(dǎo)96 h的差異蛋白質(zhì)組分析 雙向電泳之后，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)分布模式基本一致，所獲12張蛋白質(zhì)膠圖平均含有(2 234±76)個(gè)點(diǎn)。以Cy2圖像為標(biāo)準(zhǔn)，與其他各圖譜相匹配，匹配率約為88.1%。用軟件分析NGF誘導(dǎo)PC12細(xì)胞分化晚期(96 h)的蛋白質(zhì)表達(dá)，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比有58個(gè)蛋白點(diǎn)表達(dá)量顯著改變，經(jīng)過(guò)質(zhì)譜鑒定，獲得其中10個(gè)蛋白質(zhì)的明確質(zhì)譜信息，見(jiàn)圖2、圖3及表2。其中NF-M、NF-L、α-tubulin 2、tubulin β-15、annexin Ⅴ、TM 等 6 個(gè)蛋白表達(dá)上調(diào)，而VCP、TH、RNA解旋酶、GST等4個(gè)蛋白表達(dá)下調(diào)。如圖2A所示點(diǎn)d的5個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)分子量相當(dāng)，等電點(diǎn)間隔相同，而且各點(diǎn)的質(zhì)譜鑒定結(jié)果完全一致，提示這一列蛋白點(diǎn)為發(fā)生不同程度修飾的同一蛋白。

圖2 NGF誘導(dǎo)PC12細(xì)胞96 h的蛋白質(zhì)組學(xué)分析圖譜

圖3 蛋白點(diǎn)h的MALDI-TOF-MS鑒定結(jié)果

表2 NGF作用96 h后差異表達(dá)蛋白的質(zhì)譜鑒定結(jié)果

3 討論

蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的關(guān)鍵在于蛋白質(zhì)的分離和鑒定，二維電泳(2DE)是目前分離蛋白質(zhì)的主要手段，但是傳統(tǒng)的2DE技術(shù)靈敏度較低，結(jié)果可靠性、重復(fù)性較差。DIGE技術(shù)〔1〕在傳統(tǒng)雙向電泳技術(shù)的基礎(chǔ)上，結(jié)合了多重?zé)晒夥治龅姆椒?，在同一塊膠上共同分離多個(gè)分別由不同熒光標(biāo)記的樣品，極大地提高了結(jié)果的準(zhǔn)確性、可靠性和重復(fù)性，被認(rèn)為是目前定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究中可信度和準(zhǔn)確率最高的技術(shù)之一。

本實(shí)驗(yàn)中，NGF作用PC12細(xì)胞96 h后，共發(fā)現(xiàn)58個(gè)表達(dá)量變化的蛋白點(diǎn)，質(zhì)譜獲得其中10種蛋白質(zhì)的明確信息。其中有5種結(jié)構(gòu)蛋白，即 NF-M、NF-L、α tubulin-2、tubulinβ-15和TM，他們的表達(dá)均增高，參與構(gòu)成微管、微絲及中間絲蛋白等細(xì)胞結(jié)構(gòu)。

蛋白點(diǎn) b為含纈酪肽蛋白(valosin-containing protein，VCP)，是三磷酸腺苷酶超家族中的一員，又稱(chēng)黑色素轉(zhuǎn)鐵蛋白或p97。VCP的底物多樣〔2〕，包括有絲分裂的細(xì)胞周期蛋白以及細(xì)胞周期蛋白激酶抑制劑p27、原癌基因產(chǎn)物p53、c-myc、c-Jun、I-κB等。因而VCP在膜融合、細(xì)胞分裂周期調(diào)控、細(xì)胞內(nèi)蛋白的運(yùn)輸和調(diào)控以及細(xì)胞凋亡等活動(dòng)中均發(fā)揮著重要作用。

蛋白點(diǎn)d被鑒定為T(mén)H，該酶是兒茶酚胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)合成過(guò)程中的限速酶，催化酪氨酸轉(zhuǎn)變成L-多巴，膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子能夠誘導(dǎo)中腦源干細(xì)胞表達(dá)TH〔3〕。有報(bào)道顯示，低濃度(1μg/ml)NGF作用早期，交感神經(jīng)元內(nèi)TH水平下降，此時(shí)NGF主要通過(guò)細(xì)胞表面受體促使軸突的形成;而高濃度NGF(100μg/ml)則通過(guò)神經(jīng)末梢攝取和軸突的逆向轉(zhuǎn)運(yùn)到達(dá)胞體，誘導(dǎo)TH表達(dá)和細(xì)胞生存〔4〕。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用的NGF濃度為50 ng/ml，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于引起TH表達(dá)所需的NGF濃度，推測(cè)這是TH表達(dá)下調(diào)的主要原因。

經(jīng)質(zhì)譜鑒定，蛋白點(diǎn)h為膜聯(lián)蛋白Ⅴ。膜聯(lián)蛋白具有抑制磷脂酶A2及蛋白激酶C活性、參與細(xì)胞骨架活動(dòng)、參與磷脂化與膜受體的功能調(diào)節(jié)、抗凝、傳導(dǎo)有絲分裂信號(hào)以及促進(jìn)細(xì)胞分泌等重要生理功能〔5〕。本研究中實(shí)驗(yàn)組的膜聯(lián)蛋白Ⅴ表達(dá)顯著增高，其在NGF誘導(dǎo)PC12細(xì)胞分化過(guò)程中的具體作用還需進(jìn)一步探索。

蛋白點(diǎn)g經(jīng)質(zhì)譜鑒定證實(shí)為RNA解旋酶，此酶能夠使雙鏈RNA解鏈，作用于RNA-蛋白復(fù)合體使其中RNA解離。細(xì)胞內(nèi)RNA轉(zhuǎn)錄、加工剪接及核糖體組裝都需要解旋酶的參與〔6〕。本實(shí)驗(yàn)在NGF誘導(dǎo)PC12細(xì)胞分化的蛋白質(zhì)組學(xué)研究中檢測(cè)到RNA解旋酶的表達(dá)降低35%。推測(cè)此時(shí)ATP水解耗能減少，以節(jié)約能量用于細(xì)胞分化過(guò)程。

點(diǎn)j為GST Y-b亞單位，GST是細(xì)胞抗損傷、抗癌變的重要解毒酶系，主要催化還原型谷胱甘肽(GSH)與親電子化合物的結(jié)合，使后者失去結(jié)合DNA的活性，在代謝環(huán)境致癌物和化療藥物中發(fā)揮重要作用〔7〕。在本實(shí)驗(yàn)中，檢測(cè)到GST含量降低，這可能與NGF誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞分化過(guò)程有關(guān)。

綜上所述，本研究應(yīng)用DIGE技術(shù)結(jié)合MALDI-TOF質(zhì)譜分離鑒定了一批在NGF處理的PC12細(xì)胞中表達(dá)發(fā)生顯著改變的蛋白。這些蛋白可能是NGF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程的新成員，也可以成為藥物治療的新靶點(diǎn)。

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Q503

A

1005-9202(2011)12-2267-03

1 吉林大學(xué)第二醫(yī)院兒科 2 長(zhǎng)春市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科

3 吉林大學(xué)第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科

胡林森(1949-)，男，教授，博士生導(dǎo)師，從事神經(jīng)變性病的機(jī)制研究。

侯 澍(1978-)，女，醫(yī)師，博士，從事神經(jīng)系統(tǒng)血管性疾病的機(jī)制和治療研究。

〔2010-10-20收稿 2011-02-25修回〕

(編輯 徐 杰)