帥英麗，于紅艷，李志強(qiáng)

天津生物化學(xué)制藥有限公司，天津 300308

銀杏葉提取物是從我國特有的銀杏科植物銀杏（Ginkgo biloba L.）的干燥葉中得到的提取物，具有斂肺、活血化瘀等功效，20世紀(jì)60年代以來，國內(nèi)外學(xué)者對銀杏葉的化學(xué)成分、藥理及臨床做了大量的工作，現(xiàn)國內(nèi)外已有多種制劑上市。其主要含有黃酮類、萜類內(nèi)酯類和酚酸類化合物，《中國藥典》2005年版（一部）對銀杏葉提取物中黃酮及萜類內(nèi)酯類的含量均有規(guī)定，但是因?yàn)橹兴幊煞值膹?fù)雜性，往往控制這兩種成分還不能真實(shí)反映其質(zhì)量，而色譜指紋圖譜分析可以使中藥所含多種化學(xué)成分的整體可視化，為更好地控制產(chǎn)品的質(zhì)量提供了可行性。為了更好地控制產(chǎn)品的質(zhì)量，采用高效液相色譜法對本品指紋圖譜進(jìn)行了研究，得到了分離度、重現(xiàn)性均較好的銀杏葉提取物特征指紋圖譜，為其質(zhì)量控制提供了依據(jù)，也為銀杏葉提取物以及銀杏葉的指紋圖譜國家標(biāo)準(zhǔn)的確立提供了更為科學(xué)的依據(jù)和有效的鑒別方法[1]。

1 儀器和試藥

Shimadzu LC-10AT VP雙泵高效液相色譜儀，Shimadzu SPD-10A VP紫外檢測器，Classvp色譜工作站。乙腈、異丙醇為色譜純，磷酸、磷酸二氫鉀、檸檬酸均為分析純，蘆丁對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)：100080-200707），銀杏葉對照提取物 （中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)：100080-200609），銀杏葉提取物 （北京康立生醫(yī)藥技術(shù)開發(fā)有限公司， 批號(hào)：00601、00602、00603、00701、00702、00703、00801、00802、00803、00901）。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 參照物溶液的制備 精密稱取蘆丁對照品適量，加50%甲醇制成每1 ml含0.03 mg的溶液，即得。

2.1.2 對照提取物的制備 精密稱取銀杏葉對照提取物0.087 5 g，置于25 ml量瓶中，水浴加熱使溶解，用水稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜（0.45 μm）濾過，即得。

2.1.3 供試品溶液的制備 精密稱取銀杏葉提取物0.087 5 g，置于25 ml量瓶中，水浴加熱使溶解，用水稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜（0.45 μm）濾過，即得。

2.1.4 測定法 分別精密吸取參照物溶液、對照提取物溶液與供試品溶液各10 ml，注入液相色譜儀，測定，記錄0～100 min的色譜峰，即得。

2.2 色譜條件

Diamonsil（C18，250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱；檢測波長：360 nm；流速：1.0 ml/min；柱溫：25℃；流動(dòng)相（A）：水-乙腈-異丙醇-檸檬酸（1 000∶470∶50∶6.08）；流動(dòng)相（B）：水-乙腈-異丙醇-檸檬酸（1 400∶200∶30∶6.88）；梯度洗脫條件見表1。

表1 梯度洗脫條件

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 檢測波長的選擇 取蘆丁對照品溶液，在200～400 nm波長范圍進(jìn)行掃描，結(jié)果在255 nm和360 nm波長處有最大吸收；另取槲皮素、山奈素、異鼠李素的線性范圍分別為0.050～0.400 μg、0.005～0.040 μg、0.005～0.040 μg，在 200～400 nm波長范圍對槲皮素、山奈素、異鼠李素對照品溶液進(jìn)行掃描，結(jié)果分別在368 nm、366 nm、370 nm波長處有最大吸收，考慮到指紋圖譜檢測的色譜峰主要是黃酮醇苷，所以選擇360 nm作為檢測波長。

2.3.2 參照物確定試驗(yàn) 銀杏葉提取物中蘆丁的含量較大，在此色譜條件下所獲得的色譜相應(yīng)值較高，所以選擇蘆丁作為參照物，照“2.1”項(xiàng)下的要求制備參照物溶液，進(jìn)樣 10 μl，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，其主峰的保留時(shí)間用于確定銀杏葉提取物中蘆丁峰的峰位[2]。

2.3.3 精密度試驗(yàn) 取同一份供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，各主要色譜峰的相對保留時(shí)間及相對峰面積比值的RSD分別為2.68%和2.44%，均＜3%，表明精密度良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批銀杏葉提取物，照“2.3”項(xiàng)下的要求制備供試品溶液，進(jìn)樣 10 μl，分別在 0、2、6、12、24 h 不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)樣，各主要色譜峰的相對保留時(shí)間及相對峰面積比值的RSD分別為2.48%和2.88%，均小于3%，表明供試品溶液至少在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批銀杏葉提取物6份，按供試品溶液的制備和檢測方法分別進(jìn)行檢測，各主要色譜峰的相對保留時(shí)間及相對峰面積比值的RSD分別為2.89%和2.15%，均小于3%。表明本方法的重復(fù)性良好。

2.3.6 樣品測定及結(jié)果 13個(gè)共有峰相對保留時(shí)間及相對峰面積的RSD均＜3.0%，經(jīng)中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)軟件計(jì)算，除有個(gè)別峰有一定的差別，10批樣品相互之間相似度均＞0.90。說明樣品間質(zhì)量重復(fù)性較好，符合測試要求。見表1、2及圖1。

表1 不同批次銀杏葉提取物指紋圖譜的測定結(jié)果（相對保留時(shí)間）

表2 不同批次銀杏葉提取物指紋圖譜的測定結(jié)果（相對峰面積）

3 討論

3.1 流動(dòng)相的選擇

銀杏葉提取物中所含成分極性跨度很大，其含量最多的黃酮類成分含有多個(gè)酚羥基[3]，呈弱酸性，故使用酸性緩沖體系，分別選用了醋酸體系和檸檬酸體系，實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)使用檸檬酸體系可以得到更好的分離條件及峰形，又比較了甲醇-檸檬酸與乙腈-檸檬酸體系，發(fā)現(xiàn)乙腈-檸檬酸體系更好，同時(shí)發(fā)現(xiàn)流動(dòng)相中加入適量的異丙醇可以使峰形對稱度更好。

3.2 色譜柱的選擇

由于銀杏葉提取物中所含的成分主要為黃酮醇苷類[4]，故選擇了C18反相柱，實(shí)驗(yàn)中分別使用了四種不同廠家的C18反相柱。 ①Kromasil（C18，250 mm×4.6 mm，5 μm）；②Agilent（C18，250 mm×4.6 mm，5 μm）； ③Diamonsil （C18，250 mm×4.6mm，5μm）。 結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)所用的 Diamonsil（C18，250 mm×4.6 mm，5 μm）分離較果最佳，重現(xiàn)性好。

3.3 樣品測定

測定本品10批樣品，本品指紋圖譜中出現(xiàn)13個(gè)共有峰，以對照提取物為對照，經(jīng)中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)軟件計(jì)算，10批樣品與對照提取物相似度均＞0.90，故規(guī)定本品與對照提取物，經(jīng)中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)軟件計(jì)算，相似度不得＜0.90。

[1]王京輝,杜小偉,王萌萌,等.舒血寧注射液、銀杏葉提取物及銀杏葉指紋圖譜研究[J].藥物分析雜志,2008,28(7)：1026-1030.

[2]國家食品藥品監(jiān)督管理局.中藥注射劑指紋圖譜研究的技術(shù)要求(暫行)[S].2003.

[3]Teris A van Beek Analysis and Quality control of Ginkgo biloba Leaves and Standardised Extracts[J].Proceedings of 97 International Seminar on Ginkgo,1997：158.

[4]葉秀波,岑幗英,李瑞明.HPLC法測定銀杏葉軟膠囊中總黃酮的含量[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報(bào),2010,7(33)：29-30.