帥英麗,于紅艷,李志強(qiáng)
天津生物化學(xué)制藥有限公司,天津 300308
銀杏葉提取物是從我國特有的銀杏科植物銀杏(Ginkgo biloba L.)的干燥葉中得到的提取物,具有斂肺、活血化瘀等功效,20世紀(jì)60年代以來,國內(nèi)外學(xué)者對銀杏葉的化學(xué)成分、藥理及臨床做了大量的工作,現(xiàn)國內(nèi)外已有多種制劑上市。其主要含有黃酮類、萜類內(nèi)酯類和酚酸類化合物,《中國藥典》2005年版(一部)對銀杏葉提取物中黃酮及萜類內(nèi)酯類的含量均有規(guī)定,但是因?yàn)橹兴幊煞值膹?fù)雜性,往往控制這兩種成分還不能真實(shí)反映其質(zhì)量,而色譜指紋圖譜分析可以使中藥所含多種化學(xué)成分的整體可視化,為更好地控制產(chǎn)品的質(zhì)量提供了可行性。為了更好地控制產(chǎn)品的質(zhì)量,采用高效液相色譜法對本品指紋圖譜進(jìn)行了研究,得到了分離度、重現(xiàn)性均較好的銀杏葉提取物特征指紋圖譜,為其質(zhì)量控制提供了依據(jù),也為銀杏葉提取物以及銀杏葉的指紋圖譜國家標(biāo)準(zhǔn)的確立提供了更為科學(xué)的依據(jù)和有效的鑒別方法[1]。
Shimadzu LC-10AT VP雙泵高效液相色譜儀,Shimadzu SPD-10A VP紫外檢測器,Classvp色譜工作站。乙腈、異丙醇為色譜純,磷酸、磷酸二氫鉀、檸檬酸均為分析純,蘆丁對照品(中國藥品生物制品檢定所,批號(hào):100080-200707),銀杏葉對照提取物 (中國藥品生物制品檢定所,批號(hào):100080-200609),銀杏葉提取物 (北京康立生醫(yī)藥技術(shù)開發(fā)有限公司, 批號(hào):00601、00602、00603、00701、00702、00703、00801、00802、00803、00901)。
2.1.1 參照物溶液的制備 精密稱取蘆丁對照品適量,加50%甲醇制成每1 ml含0.03 mg的溶液,即得。
2.1.2 對照提取物的制備 精密稱取銀杏葉對照提取物0.087 5 g,置于25 ml量瓶中,水浴加熱使溶解,用水稀釋至刻度,搖勻,用微孔濾膜(0.45 μm)濾過,即得。
2.1.3 供試品溶液的制備 精密稱取銀杏葉提取物0.087 5 g,置于25 ml量瓶中,水浴加熱使溶解,用水稀釋至刻度,搖勻,用微孔濾膜(0.45 μm)濾過,即得。
2.1.4 測定法 分別精密吸取參照物溶液、對照提取物溶液與供試品溶液各10 ml,注入液相色譜儀,測定,記錄0~100 min的色譜峰,即得。
Diamonsil(C18,250 mm×4.6 mm,5 μm)色譜柱;檢測波長:360 nm;流速:1.0 ml/min;柱溫:25℃;流動(dòng)相(A):水-乙腈-異丙醇-檸檬酸(1 000∶470∶50∶6.08);流動(dòng)相(B):水-乙腈-異丙醇-檸檬酸(1 400∶200∶30∶6.88);梯度洗脫條件見表1。
表1 梯度洗脫條件
2.3.1 檢測波長的選擇 取蘆丁對照品溶液,在200~400 nm波長范圍進(jìn)行掃描,結(jié)果在255 nm和360 nm波長處有最大吸收;另取槲皮素、山奈素、異鼠李素的線性范圍分別為0.050~0.400 μg、0.005~0.040 μg、0.005~0.040 μg,在 200~400 nm波長范圍對槲皮素、山奈素、異鼠李素對照品溶液進(jìn)行掃描,結(jié)果分別在368 nm、366 nm、370 nm波長處有最大吸收,考慮到指紋圖譜檢測的色譜峰主要是黃酮醇苷,所以選擇360 nm作為檢測波長。
2.3.2 參照物確定試驗(yàn) 銀杏葉提取物中蘆丁的含量較大,在此色譜條件下所獲得的色譜相應(yīng)值較高,所以選擇蘆丁作為參照物,照“2.1”項(xiàng)下的要求制備參照物溶液,進(jìn)樣 10 μl,注入高效液相色譜儀,記錄色譜圖,其主峰的保留時(shí)間用于確定銀杏葉提取物中蘆丁峰的峰位[2]。
2.3.3 精密度試驗(yàn) 取同一份供試品溶液,連續(xù)進(jìn)樣6次,各主要色譜峰的相對保留時(shí)間及相對峰面積比值的RSD分別為2.68%和2.44%,均<3%,表明精密度良好。
2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批銀杏葉提取物,照“2.3”項(xiàng)下的要求制備供試品溶液,進(jìn)樣 10 μl,分別在 0、2、6、12、24 h 不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)樣,各主要色譜峰的相對保留時(shí)間及相對峰面積比值的RSD分別為2.48%和2.88%,均小于3%,表明供試品溶液至少在24 h內(nèi)穩(wěn)定。
2.3.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批銀杏葉提取物6份,按供試品溶液的制備和檢測方法分別進(jìn)行檢測,各主要色譜峰的相對保留時(shí)間及相對峰面積比值的RSD分別為2.89%和2.15%,均小于3%。表明本方法的重復(fù)性良好。
2.3.6 樣品測定及結(jié)果 13個(gè)共有峰相對保留時(shí)間及相對峰面積的RSD均<3.0%,經(jīng)中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)軟件計(jì)算,除有個(gè)別峰有一定的差別,10批樣品相互之間相似度均>0.90。說明樣品間質(zhì)量重復(fù)性較好,符合測試要求。見表1、2及圖1。
表1 不同批次銀杏葉提取物指紋圖譜的測定結(jié)果(相對保留時(shí)間)
表2 不同批次銀杏葉提取物指紋圖譜的測定結(jié)果(相對峰面積)
銀杏葉提取物中所含成分極性跨度很大,其含量最多的黃酮類成分含有多個(gè)酚羥基[3],呈弱酸性,故使用酸性緩沖體系,分別選用了醋酸體系和檸檬酸體系,實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)使用檸檬酸體系可以得到更好的分離條件及峰形,又比較了甲醇-檸檬酸與乙腈-檸檬酸體系,發(fā)現(xiàn)乙腈-檸檬酸體系更好,同時(shí)發(fā)現(xiàn)流動(dòng)相中加入適量的異丙醇可以使峰形對稱度更好。
由于銀杏葉提取物中所含的成分主要為黃酮醇苷類[4],故選擇了C18反相柱,實(shí)驗(yàn)中分別使用了四種不同廠家的C18反相柱。 ①Kromasil(C18,250 mm×4.6 mm,5 μm);②Agilent(C18,250 mm×4.6 mm,5 μm); ③Diamonsil (C18,250 mm×4.6mm,5μm)。 結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)所用的 Diamonsil(C18,250 mm×4.6 mm,5 μm)分離較果最佳,重現(xiàn)性好。
測定本品10批樣品,本品指紋圖譜中出現(xiàn)13個(gè)共有峰,以對照提取物為對照,經(jīng)中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)軟件計(jì)算,10批樣品與對照提取物相似度均>0.90,故規(guī)定本品與對照提取物,經(jīng)中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)軟件計(jì)算,相似度不得<0.90。
[1]王京輝,杜小偉,王萌萌,等.舒血寧注射液、銀杏葉提取物及銀杏葉指紋圖譜研究[J].藥物分析雜志,2008,28(7):1026-1030.
[2]國家食品藥品監(jiān)督管理局.中藥注射劑指紋圖譜研究的技術(shù)要求(暫行)[S].2003.
[3]Teris A van Beek Analysis and Quality control of Ginkgo biloba Leaves and Standardised Extracts[J].Proceedings of 97 International Seminar on Ginkgo,1997:158.
[4]葉秀波,岑幗英,李瑞明.HPLC法測定銀杏葉軟膠囊中總黃酮的含量[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報(bào),2010,7(33):29-30.