安紅鋼，林敏，任雪峰，于文廣，吳冬青

(河西學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，甘肅省高校河西走廊特色資源利用省級重點實驗室，甘肅張掖734000)

茄子Solanum melongena L.是一年生草本植物，亞洲、地中海、中歐及東南歐地區(qū)廣泛栽培的蔬菜作物［1］。茄子是我國普遍食用的蔬菜，價格低廉，容易取材，而茄蒂(茄子的萼片)常作為茄子的下腳料丟棄。茄子全身均可入藥，茄蒂可治風(fēng)下血不止、血痔、口齒瘡、癜風(fēng)等［2］。本實驗以茄蒂黃酮為主要指標，在單因素試驗基礎(chǔ)上，借助SAS9.2統(tǒng)計分析軟件，采用響應(yīng)曲面法的Box-Behnken設(shè)計優(yōu)化出茄蒂黃酮最佳提取工藝。又通過體外實驗進行抗氧化作用研究，并應(yīng)用Origin分析軟件對實驗數(shù)據(jù)進行線性回歸，計算清除自由基的IC50和還原力的IC0.5。研究結(jié)果以期為該植物資源的充分利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

茄子(張掖市產(chǎn)紫黑色長茄子)購于蔬菜市場，取下茄蒂，洗凈、晾干，粉碎備用。

DPPH Sigma公司;鄰二氮菲、雙氧水、硫酸亞鐵、三氯乙酸、鄰苯三酚、三羥甲基氨基甲烷、三氯化鐵等均為分析純。實驗用水為二次水。

WFJ2100型可見分光光度計(尤尼柯儀器有限公司);RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海青浦瀘西儀器廠);SHB-III循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司);國華HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州國華電器有限公司)等。

1.2 實驗方法

1.2.1 茄蒂黃酮提取工藝

1.2.1.1 提取工藝流程茄蒂→洗凈→晾干→粉碎→加入乙醇→浸泡1 h→超聲→抽濾→減壓濃縮→定容→得黃酮備用液

1.2.1.2 黃酮含量測定［3］準確移取濃度為0.24 mg/mL蘆丁標準溶液0、0.20、0.60、1.20、1.80、2.40 mL，分別置于10 mL量瓶中，加入5%NaNO20.5 mL，搖勻，放置5 min后，加入10%Al(NO3)30.5 mL，搖勻，再放置5 min，然后加4%NaOH溶液5 mL，補水至刻度，放置1 min后，在510 nm處測定吸光度(以試劑空白為參比)，以樣品濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標作圖，得回歸直線方程:y=0.303 4x+0.010 7(R2=0.999 5)。線性范圍0～0.9 mg。

1.2.1.3 單因素試驗考察料液比、乙醇濃度、超聲時間3個因素對茄蒂黃酮提取量的影響。

1.2.1.4 響應(yīng)面法試驗設(shè)計［4-5］在單因素試驗的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken的中心組合試驗設(shè)計原理，選取料液比、乙醇濃度、超聲時間為試驗因素，以茄蒂黃酮含量為響應(yīng)值，設(shè)計了三因素三水平的響應(yīng)面分析試驗，見表1。

表1 響應(yīng)面法試驗的因素水平Tab.1 The factor and level of response surface test

1.2.2 體外抗氧化作用研究

1.2.2.1 清除·OH自由基的測定方法采用鄰二氮菲-Fe2+-H2O2法測定［6-7］，并有所改動。實驗設(shè)五組:空白組、未損傷組、損傷組、樣參組、樣品組。測定波長為510 nm，按表2加樣。對照品為Vc、槲皮素、蘆丁(以下試驗相同)。

表2 鄰二氮菲-Fe2+-H2O2法各試劑組成(mL)Tab.2 Composition of reagent systems for phenanthroline-Fe2+-H2O2reaction

1.2.2.2 清除O－2·自由基的實驗方法采用鄰苯三酚自氧化法測定［8-10］，方法有所改動。取3.00 mL，pH 8.2，50 mmol/L Tris-HCl緩沖溶液，加入0.5 mL不同濃度樣品溶液，混合后在25℃水浴中預(yù)熱10 min，然后立即加入25℃預(yù)熱過的50 mmol/L鄰苯三酚0.5 mL，迅速搖勻，25℃下反應(yīng)3 min(加入鄰苯三酚開始計時)后。10 min后，在420 nm處每隔1 min測定吸光度。以等體積10 mmol/L HCl代替鄰苯三酚為空白調(diào)零，對照以等體積二次水代替樣品。

式中:A0為對照OD值;A為樣品OD值。

1.2.2.3 清除DPPH自由基的實驗方法［11-12］準確移取4 mL不同濃度樣品溶液，加入0.065 mmol/L DPPH乙醇溶液4 mL，搖勻，常溫反應(yīng)30 min后于517 nm處測定吸光度A1;同上法，95%乙醇代替DPPH溶液，測定吸光度A2;同上法，二次水代替樣品液，測定吸光度A。

1.2.2.4 還原力測定方法采用普魯士藍法［11］。移取3.00 mL不同濃度樣品溶液，分別加入0.2 mol/L pH 6.6的磷酸鹽緩沖液和1%的K3Fe(CN)6溶液各2.50 mL并混合均勻，混合液在50℃保溫20 min后加入2.50 mL 10%的三氯乙酸溶液，混合后離心(3 000 r/min)10 min。取上清液2.50 mL，加入2.50 mL二次水及0.50 mL 0.1%FeCl3溶液，混勻，靜止10 min，測定其在700 nm處的吸光度值。用吸光度值表示還原力，吸光度值越大，表明還原力越強。

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳提取工藝確定

2.1.1 響應(yīng)面試驗與分析

根據(jù)Box-Behnken設(shè)計模型，按表1以料液比、乙醇濃度、超聲時間為自變量，以茄蒂黃酮產(chǎn)量為響應(yīng)值，試驗結(jié)果見表3。

表3 Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果Tab.3 Box-Behnken experimental design and results

采用SAS9.2統(tǒng)計分析軟件對表3數(shù)據(jù)進行多元回歸分析，結(jié)果各試驗因子對響應(yīng)值的影響不是簡單的線性關(guān)系，試驗因子對響應(yīng)值影響的回歸方程為:Y=37.17+1.059X1+2.455X2－1.782－1.350XX－4.390－1.393X2X3－2.463X32

方差分析結(jié)果見表4。試驗所得的二次多項模型表現(xiàn)極其顯著(P＜0.001)，決定系數(shù)為R2=98.22%，說明回歸方程的擬合程度很好，失擬較小，回歸方程能很好地反映各因子與響應(yīng)值的關(guān)系，可預(yù)測茄蒂黃酮實際產(chǎn)量。從表4中的P值又可知，方程中X1、X2、、X1X3、、X2X3、對Y值的影響顯著，對黃酮產(chǎn)量影響大小排序為:乙醇濃度＞料液比＞提取時間。

為確定各因素的最佳取值，利用SAS9.2軟件進行嶺脊分析，得出回歸模型響應(yīng)值Y的最大估計值為37.68 mg/g，其對應(yīng)的茄蒂黃酮提取的最佳條件為:料液比1∶26(g/mL)，乙醇質(zhì)量分數(shù)73%，超聲時間30 min。

2.1.2 提取工藝優(yōu)化驗證實驗

在以上優(yōu)化條件下進行3次驗證實驗，得出茄蒂黃酮平均提取量為37.09 mg/g(37.01、37.12、37.15 mg/g)，與預(yù)測值接近。說明該方程與實驗情況擬合很好，響應(yīng)面對茄蒂黃酮提取條件的優(yōu)化是可行的。

2.2 茄蒂提取物抗氧化能力

2.2.1 對·OH自由基的清除能力

按茄蒂黃酮最佳提取條件提取3批次，提取液合并，定容，然后配制不同濃度黃酮溶液，考察茄蒂黃酮溶液抗氧化能力。按方法1.2.2.1項測定樣品在510 nm處吸光度值，代入清除率d的計算公式，結(jié)果見圖1。

圖1 乙醇提取物對·OH清除作用Fig.1 Scavenging effect of ethanol extracts on·OH radical

由圖1可知，樣品液與對照品羥自由基的清除率隨濃度增大而增大，樣品中黃酮濃度在0.2～1.4 mg/mL范圍內(nèi)液清除率高于蘆丁，與Vc和槲皮素相近。當(dāng)樣品中黃酮質(zhì)量濃度為大于1.4 mg/mL時，樣品清除率達到了96.70%。由Origin分析軟件對實驗結(jié)果線性回歸，相關(guān)系數(shù)在P＜0.001水平時都在R2＞0.92。計算得樣品、Vc、槲皮素和蘆丁的IC50值分別為0.47、0.66、0.68和0.99 mg/mL。由IC50值判斷清除羥自由基能力依次為:樣品＞Vc＞槲皮素＞蘆丁。

表4 回歸方程方差分析結(jié)果Tab.4 The variance analysis results of regression equation

2.2.2 對O－2·自由基的清除能力

鄰苯三酚自氧化過程中，在400～420 nm處會形成有光吸收的中間物，抗氧化劑抑制作用越強中間產(chǎn)物會越少，則吸光度值越低［8］。本試驗測定420 nm處吸光度，并計算其清除率。見圖2。

圖2 乙醇提取物對·清除作用Fig.2 Scavenging effect of ethanol extracts on·radical

2.2.3 對DPPH·自由基的清除能力

DPPH自由基是一種穩(wěn)定的以氮為中心的自由基，DPPH自由基乙醇溶液為深紫色，則在517 nm處有最大吸收峰。見圖3。當(dāng)有自由基清除劑存在時，DPPH自由基接受清除劑電子，而使氮原子上單電子配對呈現(xiàn)抗磁性，使溶液顏色變淡，吸光度值變?。?3］。

圖3 乙醇提取物對DPPH清除作用Fig.3 Scavenging effect of ethanol extracts on DPPH radical

圖3可看出，各溶液清除率與濃度呈正相關(guān)，在測定范圍內(nèi)，Vc清除率最顯著，樣品液次之，槲皮素與蘆丁交差上升。試驗結(jié)果進行線性回歸計算得樣品黃酮、Vc、槲皮素和蘆丁的IC50值分別為0.068、0.058、0.1和0.095 mg/mL。在P＜0.001時，4個試驗品的相關(guān)系數(shù)均＞0.94。由IC50值確定的清除率大小依次為:Vc＞樣品＞蘆丁＞槲皮素。

2.2.4 提取物還原能力

如果物質(zhì)是電子給予體，它可將Fe(CN)63－還原成Fe(CN)64－，便與Fe3+形成普魯士藍，其在700 nm處有最大吸收峰。根據(jù)吸光度值大小可確定還原能力強弱，吸光度越大，抗氧化能力越強。見圖4。

圖4 乙醇提取物還原力Fig.4 The reduction energy of the ethanol extracts

從圖4可以看出，樣品液還原能力弱于Vc和槲皮素，遠遠強于蘆丁。實驗結(jié)果線性回歸，得蘆丁、槲皮素、Vc、樣品相關(guān)系數(shù)分別為:R2=0.868 8(P＜0.01)、R2=0.939 7(P＜0.001)、R2=0.997 7(P＜0.000 1)、R2=0.984 8(P＜0.000 1)。經(jīng)計算IC0.5值(吸光度值為0.5時，所需各試驗品量)分別為:樣品黃酮質(zhì)量濃度0.60 mg/mL、Vc 0.48 mg/mL、槲皮素0.53 mg/mL和蘆丁1.29 mg/mL，還原能力依次為:Vc＞槲皮素＞樣品＞蘆丁，樣品具有較強的還原能力。

3 結(jié)論

3.1 響應(yīng)面分析法優(yōu)化茄蒂黃酮提取工藝試驗結(jié)果表明，黃酮的最佳提取工藝參數(shù)為:料液比1∶26(g/mL)，乙醇73%，超聲時間30 min，黃酮實際提取量為37.09 mg/g，與模型預(yù)測值接近，說明實驗方法合理可行，可以用回歸方程預(yù)測茄蒂黃酮實際產(chǎn)量。

3.2 實驗采用幾種體外抗氧化實驗?zāi)Ｐ脱芯苛饲训偬崛∥锏目寡趸芰?，通過這些實驗?zāi)Ｐ妥C明了茄蒂提取物具有較強的清除羥自由基、超氧陰離子自由基、DPPH自由基能力和還原力。由清除率的IC50值和還原力的IC0.5值，確定清除·OH自由基次序為:樣品＞Vc＞槲皮素＞蘆丁;清除O－2·自由基次序為:Vc＞樣品＞蘆?。鹃纹に?清除DPPH自由基的IC50值次序為Vc＞樣品＞蘆?。鹃纹に?還原力為:Vc＞槲皮素＞樣品＞蘆丁。茄蒂提取物清除·OH、O－2·、DPPH·的IC50值分別為0.47、0.58、0.068 mg/mL，相比之下提取液對DPPH·清除作用最為顯著。還原力的IC0.5值為0.60 mg/mL。結(jié)果表明，茄蒂提取物具有良好的體外抗氧化作用，作為天然抗氧化劑具有很好開發(fā)利用價值。

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