莫麗玲,肖詞英,黃鎖義,黃世穩(wěn),黃麗秀,馬連榮

(1.右江民族醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院,廣西百色 533000;2.右江民族醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系,廣西百色 533000)

八角茴香 (Illicium verum Hook.f.),又稱大茴香、八角、八月珠,是木蘭科八角屬植物,是我國南方重要的“藥食同源”的經(jīng)濟(jì)樹種,主要分布在我國的廣西、廣東、云南等省。其干燥成熟果實(shí)含有芳香油約 5%～8%,脂肪油約 22%以及蛋白質(zhì)、樹脂等,為我國的特產(chǎn)香辛料和中藥,也是居家必備的調(diào)料,在食品加工業(yè)及香料工業(yè)廣泛應(yīng)用;同時(shí)八角具有健胃止咳的功效,醫(yī)藥上用于治療神經(jīng)衰弱、消化不良、疥癬等癥,八角是抗流感特效藥“特敏?！钡闹饕蟍1]、是有效對(duì)付致命的 H 5N1禽流感病毒的藥物“達(dá)菲”的重要成分[2]。我國目前消費(fèi)的八角作香料和藥物使用,研究表明[3-5]:八角茴香的化學(xué)成分主要有揮發(fā)性化合物、倍半萜內(nèi)酯及其衍生物、黃酮類成分 (如八角茴香果實(shí)中含有 3-蕓香糖,3-葡萄糖,3-半乳糖取代的山萘酚和槲皮素,3-鼠李糖槲皮素,3-木糖槲皮素以及游離的山萘酚和槲皮素等)、苯丙烷和木脂素類、糖脂,磷脂 (包括卵磷脂、磷脂酰絲氨酸和磷脂酰肌醇),β-谷甾醇,菜油甾醇和維生素 E,胡蘿卜苷和莽草酸。紅花八角莖、葉中還含三十烷醇 -1,莽草酸和槲皮素 -3-O-鼠李糖苷。八角種子還含油酸、亞油酸、棕櫚酸和硬脂酸等脂肪酸。八角茴香的藥理作用有[3,6]:抑菌作用、升高白細(xì)胞作用、鎮(zhèn)痛作用、其它作用:茴香醚具雌激素樣作用和較強(qiáng)的致敏作用。

黃酮類成分有明顯的抗?jié)?、解痙、抗菌、抗炎、降血脂、鎮(zhèn)痛和雌性激素等生物活性和生理活性作用[7]。目前,對(duì)八角的研究多是芳香油、茴香油樹脂的提取和應(yīng)用[3]。近年來,超聲技術(shù)應(yīng)用于提取植物中的生物堿、黃酮、苷類、生物活性物質(zhì)、動(dòng)物組織漿的毒質(zhì)等研究已有報(bào)道[8],表明其具有能耗低、效率高、不破壞有效成分的特點(diǎn)。但超聲技術(shù)應(yīng)用于提取八角植物黃酮及其鑒別的研究未見報(bào)道,為此,本文應(yīng)用超聲技術(shù)提取八角植物葉總黃酮及其對(duì)羥自由基清除作用研究,現(xiàn)報(bào)道如下。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

材料:新鮮八角葉 (采自廣西南寧、賀州、河池、欽州、百色)。

試劑:95%乙醇;亞硝酸鈉 AR;硝酸鋁 AR;氫氧化鈉 AR;三氯化鋁 AR;鹽酸 AR;氨水 AR;乙酸鎂 AR;鎂粉 AR;正丁醇 AR;冰醋酸 AR;乙酸乙酯AR;蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品 (中國藥品生物制品檢定所)

儀器:KQ5200DB型數(shù)控超聲波清洗器 (超聲工作頻率 40KHz,昆山市超聲儀器有限公司);UV-755B紫外可見分光光度計(jì) (上海分析儀器總廠);ZF-I型三用紫外分析儀 (上海顧村光電儀器廠);SHB-III循環(huán)水式多用真空泵 (鄭州長城科工貿(mào)有限公司)。

1.2 測定條件的選擇

1.2.1 波長的選擇

取新鮮八角葉,烘干,粉碎。稱取八角葉的粉末5 g,分別以 60%乙醇、石油醚、蒸餾水為溶劑,分別以溫度為 80℃,功率為 100 W,超聲波提取 2.0 h,抽濾。濾渣分別再加相應(yīng)溶劑,超聲波提取 2.0 h,抽濾,各分別合并 2次濾液,即黃酮粗提液,取任意產(chǎn)地的黃酮粗提液適量,在 0.30 m L 5%亞硝酸鈉溶液存在的堿性條件下,經(jīng)硝酸鋁顯色后,以試劑為空白液在 420～700 nm波長范圍測定絡(luò)合物的吸光度,絡(luò)合物于 510 nm波長處有最大吸收,故測定時(shí)選用此波長。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密吸取蘆丁對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)溶液 (每 1 mL含有無水蘆丁 0.2 m g)0.0、2.0、4.0、6.0、8.0、12.0 mL分置再加 10%硝酸鋁溶液 2.0 mL,混勻,放置6 m in,加 5%氫氧化鈉溶液 20 m L,最后用 60%乙醇于 50 mL容量瓶中,各加 60%乙醇 12mL,加 5%亞硝酸鈉溶液 2.0 mL,混勻,放置 6 m in,稀釋至刻度,搖勻,以第 1瓶為空白溶液,用 UV-755B紫外可見分光光度計(jì),在 510 nm波長處測定吸光度,建立回歸方程,結(jié)果見表1。

表1 紫外可見分光光度計(jì)測定蘆丁對(duì)照液吸光度

根據(jù)上表得回歸方程:A=4.054 1×10-4+

1.413 6C,r=0.999 0。

1.2.3 超聲波與非超聲波提取的對(duì)比實(shí)驗(yàn)

取新鮮八角葉,烘干,粉碎。稱取八角葉的粉末5 g,分別以 60%乙醇、石油醚、蒸餾水為溶劑,分別以溫度為 80℃,功率為 100 W,超聲波提取 2.0 h,抽濾。濾渣分別再加相應(yīng)溶劑,超聲波提取 2.0 h,抽濾,各分別合并 2次濾液,即黃酮粗提液,分別取提取液稀釋 10倍,按 1.2.2節(jié)方法測其吸光度 (非超聲波法:在 1.2.3節(jié)方法中,把超聲波提取 2.0 h改為在 80℃下分別以 60%乙醇、石油醚、蒸餾水為溶劑回流提取 2.0 h,其余方法一樣)。結(jié)果見表2。

表2 超聲波與非超聲波提取液的吸光度

由表2對(duì)比可知,采用以 60%乙醇為溶劑的超聲波法提取黃酮的吸光度最大,提取效率最高。故超聲波法提取總黃酮宜用乙醇為提取溶劑。

1.2.4 不同溫度對(duì)超聲波提取總黃酮的影響

取新鮮八角葉,烘干,粉碎。稱取八角葉的粉末5 g,以 60%乙醇為溶劑,功率為 100 W,以不同溫度超聲波提取 2.0 h,抽濾。濾渣加 60%乙醇,超聲波提取 2.0 h,抽濾,合并 2次濾液,即黃酮粗提液。取提取液稀釋 10倍,按 1.2.2節(jié)方法測其吸光度,結(jié)果見表3。

表3 不同溫度超聲波提取液的吸光度

由表2可知,溫度為 80℃提取黃酮的吸光度較大,提取效率較高,故超聲波法提取總黃酮宜在 80℃進(jìn)行。

1.2.5 不同濃度乙醇對(duì)超聲波提取總黃酮的影響

取新鮮八角葉,烘干,粉碎。稱取八角葉的粉末5 g,以不同濃度乙醇為溶劑,功率為 100 W,以溫度80℃超聲波提取 2.0 h,抽濾。濾渣加相應(yīng)乙醇,超聲波提取 2.0 h,抽濾,合并 2次濾液,即黃酮粗提液。取提取液稀釋 10倍,按 1.2.2節(jié)方法測其吸光度,結(jié)果見表4。

表4 不同濃度乙醇超聲波提取液吸光度

由表4可知,乙醇濃度為 90%提取黃酮的吸光度較大,提取效率較高,故超聲波法提取總黃酮宜用90%乙醇為提取溶劑。

1.2.6 不同功率對(duì)超聲波提取總黃酮的影響

取新鮮八角葉,烘干,粉碎。稱取八角葉的粉末5 g,以不同濃度乙醇為溶劑,溫度為 80℃,不同超聲功率條件下提取 2.0 h,抽濾。濾渣加相應(yīng)乙醇,超聲波提取,抽濾,合并 2次濾液,即黃酮粗提液。取提取液稀釋 10倍,按 1.2.2節(jié)方法測其吸光度,結(jié)果見表5。

表5 不同超聲功率提取液吸光度

由表5可知,超聲功率為 60 W時(shí)總黃酮吸光度最大,提取效率最高,故超聲波法提取總黃酮宜用60 W超聲功率。

1.2.7 不同時(shí)間對(duì)超聲波提取總黃酮的影響

取新鮮八角葉,烘干,粉碎。稱取八角葉的粉末5 g,以 90%乙醇為溶劑,溫度為 80℃,功率為 60 W,在不同時(shí)間的條件下提取,抽濾。濾渣加 90%乙醇,超聲波提取相應(yīng)的時(shí)間,抽濾,分別合并 2次濾液,即黃酮粗提液。取提取液稀釋 10倍,按 1.2.2節(jié)方法測其吸光度,結(jié)果見表6。

表6 不同時(shí)間超聲波提取液吸光度

由表6可知,提取黃酮時(shí)間為 3.0 h時(shí)總黃酮吸光度較大,提取效率較高,故超聲波法提取總黃酮的提取時(shí)間為 3.0 h。

最后確定提取總黃酮的最佳工藝條件為:溶劑為 90%乙醇,溫度為 80℃,超聲波功率為 60 W,提取時(shí)間為 3.0 h。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同產(chǎn)地八角葉總黃酮含量的測定

取不同產(chǎn)地新鮮八角葉,烘干,粉碎。分別稱取八角葉的粉末 5 g,以 90%乙醇為溶劑,溫度為 80℃,功率為 60 W,提取 3.0 h,抽濾。濾渣加 90%乙醇,超聲波提取相應(yīng)的時(shí)間,抽濾,分別合并 2次濾液,即黃酮粗提液。取提取液稀釋 10倍,按 1.2.2節(jié)方法測其吸光度,結(jié)果見表7。

表7 不同產(chǎn)地總黃酮含量

2.2 回收實(shí)驗(yàn)

精密量取樣品提取液 2.0 mL,加入 2.0 mL蘆丁對(duì)照品,同 2.1節(jié)方法測定吸光度,求出回收率為97.25%。

2.3 鑒別實(shí)驗(yàn)

2.3.1 顏色反應(yīng)[9]

取八角黃酮提取液進(jìn)行顏色反應(yīng),結(jié)果為:紫外光下呈色反應(yīng)有灰褐色并有熒光斑點(diǎn);濃氨水反應(yīng)紫外光下有極明顯的黃褐色熒光斑點(diǎn);三氯化鋁反應(yīng)紫外光下有黃色熒光斑點(diǎn);乙酸鎂反應(yīng)紫外光下有黃色斑點(diǎn);鹽酸 -鎂粉反應(yīng)有紫紅色。

2.3.2 紙層析[9]

用正丁醇 ∶醋酸 ∶水 =4∶1∶5(體積比 )為展開劑 ,取樣品溶液進(jìn)行紙層析,在紫外光下呈熒光斑點(diǎn)。

2.4 藥理實(shí)驗(yàn)[10]

參照 Fenton反應(yīng)的方法建立反應(yīng)體系模型[11],通過 H2O2與 Fe2+混合產(chǎn)生·OH,但由于·OH具有很高的反應(yīng)活性,存活時(shí)間短,若在反應(yīng)體系中加入水楊酸,就能有效地捕捉·OH,并產(chǎn)生有色產(chǎn)物。根據(jù)固定反應(yīng)時(shí)間法,在相同體積的反應(yīng)體系 (8.8 mmo l/L H2O21 m L,9 mmo l/L Fe2+1 m L,9 mmo l/L 1 mL水楊酸 -乙醇溶液)加入一系列不同濃度的總黃酮提取液,在 510 nm處分別測其對(duì)·OH的清除作用,結(jié)果見表8。

其清除率計(jì)算公式:

結(jié)果表明,八角葉總黃酮提取液對(duì)由 Fenton體系產(chǎn)生的·OH有很好的清除作用,清除率隨著黃酮類物質(zhì)濃度的增大而增大。

表8 不同濃度的總黃酮提取液對(duì)·OH的清除率

3 結(jié) 論

超聲波提取八角葉總黃酮的最佳工藝條件是:

溶劑 90%乙醇,溫度 80℃,超聲波功率 60 W,提取時(shí)間 3.0 h,超聲波提取效率遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)的乙醇浸提法,河池產(chǎn)八角葉總黃酮含量最高,其次是欽州和百色,提取物總黃酮對(duì)羥自由基有很好的清除作用,為八角的藥效學(xué)、藥代動(dòng)力學(xué)、分子藥理學(xué)和制劑學(xué)等方面進(jìn)行進(jìn)一步的研究工作提供了參考依據(jù)。

(注:本文榮獲 2009年廣西高?；瘜W(xué)化工類論文及設(shè)計(jì)競賽三等獎(jiǎng))

[1] 法新社.中草藥風(fēng)行全球,大錢被日韓賺了 [N].參考消息,2005-10-29(8).

[2] 法新社.八角茴香:對(duì)付禽流感的利器[N].參考消息,2005-11-02(7).

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