李 娜 張 雷 安鵬麗 高云歡 張 麗 王家鑫

(河北農(nóng)業(yè)大學動物科技學院免疫學實驗室,保定071000)

口蹄疫(Foot-and-mouth disease,FMD)是由口蹄疫病毒(FMD virus,FMDV)感染偶蹄動物所引起的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病,目前尚無理想的防治措施[1,2]。業(yè)已證明,細胞免疫應答在清除病毒感染過程中發(fā)揮重要作用,并且動物產(chǎn)生抗FMDV抗體的過程也依賴于細胞免疫應答[3],但目前對機體抗FMDV細胞免疫應答的機制仍不甚清楚。

FMDV是由 VP1、VP2、VP3和 VP4四種衣殼蛋白包裹單股正鏈RNA組成的正二十面體結(jié)構。其中VP1、VP2和VP3位于衣殼的表面,VP4位于衣殼的內(nèi)部[1,4]。一般認為,該病毒的主要抗原位點在VP1的G-H環(huán)上,其特定氨基酸序列構成能夠刺激免疫應答的T、B細胞抗原表位,在其頂部形成一個高度保守的Arg-G ly-Asp(RG D)序列,是 FMDV與宿主細胞受體相結(jié)合的位點,并且VP1蛋白質(zhì)可誘導產(chǎn)生中和抗體[1,5]。因此,VP1成為各類新型疫苗研究的候選抗原之一。無論是原核表達系統(tǒng),還是真核表達系統(tǒng)所表達的VP1均可刺激動物產(chǎn)生體液免疫應答,但目前尚不清楚VP1刺激細胞免疫應答的機制[6-8]。

樹突狀細胞(Dendritic cell,DC)是啟動細胞免疫應答的專職抗原提呈細胞,可通過多種抗原提呈途徑啟動細胞免疫應答[9]。DC組成性表達MHCⅡ類分子,可將外源性抗原提呈給CD4+T細胞,使之分化為Th1、Th2、Th17和T reg細胞等。其中Th1細胞在清除細胞內(nèi)病毒感染過程中發(fā)揮至關重要的作用[10]。

本研究用原核表達載體pET32a表達口蹄疫病毒VP1蛋白質(zhì),將其負載小鼠骨髓源樹突狀細胞(Bone morrow-derived dendritic cell,BMDC),再與小鼠頸淺淋巴結(jié)T細胞共培養(yǎng),通過檢測共培養(yǎng)物上清液中 IFN-γ的含量,探討負載VP1蛋白質(zhì)的BMDC對T細胞的活化效應。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和實驗動物 限制性內(nèi)切酶NcoⅠ、XhoⅠ為英國NEB公司產(chǎn)品。T4 DNA連接酶、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒及質(zhì)粒小提試劑盒購自大連TaKaRa公司。重組小鼠粒細胞-單核細胞集落刺激因子(rmG M-CSF)購于Biodesign公司。重組小鼠白介素 4(rmIL-4)、小鼠 IFN-γELISA試劑盒購自R&D Systems公司。小鼠6×His抗體及辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠 IgG二抗為Abcam公司產(chǎn)品。BALB/c雄性小鼠(6～8周齡)購自河北醫(yī)科大學實驗動物中心(許可證號：SCXK(冀)2008-1-003)。

1.2 菌株與載體 DH5α和BL21(DE3)菌株購自天根生化科技(北京)有限公司。pET32a原核表達載體由本實驗室保存。重組質(zhì)粒pUC57-VP1由生工生物工程(上海)有限公司合成。

1.3 方法

1.3.1 pET32a-VP1原核表達、純化及鑒定 重組質(zhì)粒pUC57-VP1和原核表達載體pET32a經(jīng)NcoⅠ、XhoⅠ雙酶切,回收后16℃下連接過夜,將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌感受態(tài)細胞,挑斑、于含有100 mg/L氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng),以堿裂解法制備質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化BL21(DE3),制備質(zhì)粒,然后經(jīng)酶切篩選陽性克隆,取酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒送生工生物工程(上海)有限公司測序。

將測序正確的陽性克隆菌液以1∶100的比例加到上述LB液體培養(yǎng)基中,37℃,180 r/min振搖培養(yǎng)至對數(shù)生長期(OD600=0.6～1.0),加入終濃度為1.0 mmol/L的IPTG,30℃,180 r/min振搖誘導培養(yǎng)5小時,離心表達菌液,棄上清,用PBS(pH7.4)重懸沉淀,再加入等體積的2×SDS上樣緩沖液,充分混勻,然后100℃變性10分鐘,12 000 r/min離心5分鐘,取上清進行12%SDS-聚丙烯酰氨凝膠電泳(SDSPAGE)。完成后取出聚丙烯酰胺凝膠并用去離子水沖洗3次,再用預冷的含1 mmol/L DTT的0.25 mol/L KCl溶液于4℃浸泡10分鐘。電泳條帶清晰時參照標準蛋白從凝膠上切下表達產(chǎn)物所處的條帶,裝入透析袋中。加適量的新鮮pH7.2的 PB緩沖液,將透析袋放入到洗脫槽中,恒壓80 V電泳至膠條透明,然后倒轉(zhuǎn)電極電泳5分鐘。將透析袋放入盛有聚乙二醇(PEG6000)的平皿中進行濃縮,大約10分鐘后收集電洗脫液,即純化的目的重組蛋白。將純化目的蛋白進行SDS-PAGE,并將其轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,5%脫脂奶粉4℃封閉過夜,以小鼠6×His抗體為一抗,辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG為二抗,ECL顯色。對純化的目的蛋白進行濃度測定,置-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 骨髓源樹突狀細胞及淋巴結(jié)T細胞的制備

將6～8周齡的BALB/c小鼠,用頸椎脫臼法處死,無菌條件下取股骨、脛骨,用注射器抽吸 PBS沖出骨髓,1 500 r/min離心5分鐘,棄上清,然后加入適量無菌三蒸水裂解紅細胞。PBS充分洗滌后,用含10%胎牛血清、10 ng/ml rmG M-CSF、1 ng/ml rmIL-4的RPMI1640培養(yǎng)液配成1×106ml-1的細胞懸液,接種于細胞培養(yǎng)板中,37℃、50 ml/L CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第3天,輕輕吸棄未貼壁細胞,全量換液。第6天,半量換液。第8天,收集懸浮細胞,即為小鼠骨髓源樹突狀細胞(BMDC)[11]。

淋巴結(jié)T細胞的制備按本室報道的方法進行,主要步驟如下,在無菌條件下摘取小鼠頸淺淋巴結(jié),于200目篩網(wǎng)研磨過濾,收集細胞,用淋巴細胞分離液分離單個核細胞,放入37℃、50 ml/L CO2培養(yǎng)箱中1小時,用毛細吸管吸出未貼壁的細胞懸液,即淋巴結(jié)T細胞[12]。

1.3.3 骨髓源樹突狀細胞負載FMDV VP1蛋白質(zhì)與淋巴結(jié)T細胞共培養(yǎng) 在細胞培養(yǎng)板中將FMDV VP1蛋白質(zhì)負載1×105ml-1BMDC,4小時后與淋巴結(jié)T細胞按照1∶5的比例共培養(yǎng)。以BMDC與淋巴結(jié)T細胞培養(yǎng)系統(tǒng)作為陰性對照,以單純BMDC作為空白對照。分別于共培養(yǎng)后3、9、24和48小時(每個時間點設3個復孔)收集對應孔中培養(yǎng)上清液,用 ELISA檢測其IFN-γ含量。

2 結(jié)果

2.1 pET32a-VP1原核表達載體的構建與鑒定 構建的pET32a-VP1重組質(zhì)粒經(jīng)過NcoⅠ和XhoⅠ雙酶切出現(xiàn)2條片段：小片段為639 bp的目的片段,大片段為5 900 bp的pET32a載體片段(圖1A),提示目的片段成功插入載體中。DNA測序結(jié)果顯示：插入的VP1序列與 GenBank中Foot-and-mouth disease virus O isolate O/NY OO基因(AY333431.1)VP1編碼序列的同源性完全相符。

2.2 pET32a-VP1原核表達、純化及鑒定 將轉(zhuǎn)化BL21(DE3)的陽性克隆菌以1.0 mmol/L IPTG,30℃,180 r/min振搖誘導培養(yǎng)5小時,然后進行SDS-PAGE電泳,考馬斯亮藍染色,可見在43 kD處有預期大小的目的條帶(圖1B)。經(jīng)過電洗脫,SDS-PAGE電泳之后,菌體的絕大部分雜蛋白已經(jīng)被除去,目的蛋白被純化(圖1B)。

用紫外分光光度計測定純化復性后的樣品在260 nm和280 nm波長的光吸收值,按下式計算樣品中的蛋白質(zhì)含量：蛋白質(zhì)濃度(mg/ml)=(1.45×A280-0.74×A260)×稀釋倍數(shù)=0.98 mg/ml。以小鼠6×His抗體為一抗,辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG為二抗進行Western blot鑒定,結(jié)果無論是純化后的目的蛋白,還是誘導后的菌體蛋白均在43 kD處呈現(xiàn)一特異反應條帶,表明該表達產(chǎn)物為預期的VP1蛋白(圖1C)。

2.3 BMDC的制備 在BMDC的誘導與培養(yǎng)過程中,其細胞形態(tài)與生長方式在不同時間也有所不同。當培養(yǎng)至2～3天時,有細胞集落形成,而當培養(yǎng)至4～5天時,有部分細胞從集落上脫落下來懸浮于培養(yǎng)基中,并且樹突狀特征十分明顯,當培養(yǎng)至6～7天時,大量細胞從集落上脫落下來,但樹突狀形態(tài)依然明顯(如圖2)。

2.4 負載FMDV VP1的BMDC與T細胞共培養(yǎng)系統(tǒng)中 IFN-γ的 ELISA檢測 將負載VP1的BMDC與淋巴結(jié)T細胞共培養(yǎng),以BMDC與淋巴結(jié)T細胞培養(yǎng)系統(tǒng)作為陰性對照,以單純BMDC作為空白對照。結(jié)果顯示,實驗組各時間點上清液中 IFN-γ的含量均高于對照組(3小時除外,P＞0.05),特別是在共培養(yǎng)后9小時,實驗組與對照組相比差異極顯著(P＜0.01)。在共培養(yǎng)后24小時和48小時,實驗組與對照組相比也呈現(xiàn)顯著差異(P＜0.05),有統(tǒng)計學意義(圖3)。

圖2 BMDC的體外培養(yǎng)(×400)Fig.2 Generation of BMDC in virto(×400)

圖1 原核表達載體pET32a-VP1的構建與VP1蛋白的表達Fig.1 Construction of pET32a-VP1 and expression of recombinant VP1 protein

圖3 各組上清液中IFN-γ含量對比圖Fig.3 The contents of IFN-γin supernatant from each group Note：Asterisks refer to givenPvalues.＊.P＜0.05,＊＊ .P＜0.01.

3 討論

大量實驗證明,中和抗體在機體抗FMDV感染過程中發(fā)揮主要作用。然而,中和抗體不僅不能清除細胞內(nèi)FMDV,而且也沒有交叉免疫保護作用,甚至中和抗體還可將FMDV導入DC內(nèi),使原本不感染DC的FMDV變得能夠感染DC,并最終將DC致死[2]。這可能是動物在接種疫苗后得不到抗體的免疫保護,反而出現(xiàn)持續(xù)感染的原因之一。但針對FMDV的細胞免疫應答則具有交叉免疫保護作用[13]。因此,細胞免疫應答可能在抗FMDV感染中發(fā)揮更重要的作用。尤其是CD4+T細胞,被DC提呈的MHC-肽復合物活化后分化為Th1和Th2細胞等亞類。其中Th1細胞主要分泌IFN-γ、IL-2和TNF-β,三種細胞因子協(xié)同作用加強吞噬細胞的功能,促進B細胞分化和T細胞依賴性中和抗體的產(chǎn)生,以及CD8+T細胞向CT L的分化[9]。

由于FMDV VP1富含B細胞抗原表位和T細胞抗原表位,故成為各類新型疫苗研究的主要候選抗原。例如張克山等[6]構建了雙拷貝VP1基因的原核表達系統(tǒng),王曉虎等[7]構建了VP1和VP4串聯(lián)表達的真核表達系統(tǒng),二者所獲得的復合VP1蛋白質(zhì)均能刺激機體產(chǎn)生以中和抗體為特征的體液免疫應答。但目前尚未見DC捕獲VP1蛋白質(zhì)后啟動細胞免疫應答的研究報道。

本研究用原核表達載體pET32a成功表達了FMDV VP1蛋白質(zhì),將VP1負載BMDC后與淋巴結(jié)T細胞共培養(yǎng),經(jīng)ELISA檢測,上清液中含有高水平的IFN-γ,表明本文所表達的VP1可被BMDC提呈給T細胞,并使其分化為產(chǎn)生 IFN-γ的Th1細胞。如上所述,淋巴結(jié) T細胞在與負載 FMDV VP1抗原的BMDC共培養(yǎng)后9小時即大量釋放 IFN-γ,并且明顯高于兩個對照組,差異極顯著(P＜0.01),這表明BMDC在捕獲VP1抗原后可以很快啟動T細胞應答(圖3)。盡管隨著時間的推移T細胞分泌 IFN-γ的量逐漸減少,但其 IFN-γ釋放量仍顯著高于兩個對照組的釋放量,差異顯著(P＜0.05),這提示負載FMDV VP1蛋白質(zhì)后的BMDC可以有效地激活淋巴結(jié)T細胞,并產(chǎn)生以 IFN-γ為特征的Th1應答。

在我們以前的研究中發(fā)現(xiàn),在用滅活FMDV負載3小時后的DC內(nèi)即可檢測到被泛素化的FMDV蛋白,并以單鏈泛素化為主。由于單鏈泛素化蛋白主要在溶酶體內(nèi)降解,故其抗原表位被MHCⅡ類分子提呈給CD4+T細胞,活化的CD4+T細胞在共培養(yǎng)后9小時分泌大量 IFN-γ[14,15]。本實驗所制備的淋巴結(jié)T細胞主要含CD4+T細胞和CD8+T細胞,這也就是人們通常所說的淋巴結(jié)T細胞庫。盡管負載FMDV VP1蛋白質(zhì)后的BMDC也有可能激活CD8+T細胞,并分泌IFN-γ,但由于CD8+T細胞只占淋巴結(jié)T細胞庫的10-5～10-6,所以我們認為本實驗所檢測到的 IFN-γ主要是由CD4+T細胞在受到BMDC提呈的VP1抗原刺激后分化為Th1細胞所分泌的[16]?；诖宋覀兺茰y,負載FMDV VP1蛋白質(zhì)后的BMDC可以把抗原提呈給CD4+T細胞,從而啟動細胞免疫應答?？梢韵嘈?本試驗為進一步研究BMDC提呈FMDV VP1抗原的細胞與分子機制以及新型疫苗研制奠定了必要的基礎。

1 Grubman M J,Baxt B.Foot-and-mouth disease[J].Clin Microbiol Rev,2004;17(2)：465-493.

2 Robinson L,Windsor M,McLaughlin Ket al.Foot-and-mouth disease virus exhibits an altered tropism in the presence of specific immunoglobulins,enabling productive infection and killing of dendritic cells[J].J Virol,2011;85(5)：2212-2223.

3 Collen T,Pullen L,Doel T R.T cell-dependent induction of antibody against foot-and-mouth disease virus in a mouse model[J].J Gen Virol,1989;70(Pt2)：395-403.

4 Saiz M,Nú～neza J,Jimenez-Claveroc Met al.Foot and mouth disease virus：biology and prospectsfor disease control[J].Microbes Infect,2002;4(11)：1183-1192.

5 Logan D,Abu-Ghazaleh R,Blakemore Wet al.Structure of a major immunogenic site on foot-and-mouth disease virus[J].Nature,1993;362(6420)：566-568.

6 張克山,向 敏,吳 斌 et al.亞洲Ⅰ型口蹄疫病毒雙拷貝VP1基因的串聯(lián)表達及其免疫原性[J].畜牧獸醫(yī)學報,2009;40(3)：383-387.

7 王曉虎,靳玉珠,范秀波 et al.口蹄疫病毒VP1、VP4基因核酸疫苗質(zhì)粒的構建及其免疫原性[J].中國生物制品學雜志,2010;23(2)：168-171.

8 Bae J Y,Moon S H,Choi J Aet al.Recombinant DNA and protein vaccines for foot-and-mouth disease induce humoral and cellular immune responses in mice[J].Immune Netw,2009;9(6)：265-273.

9 Bedoui S,Gebhardt T.Interaction between dendritic cells and T cells during peripheral virus infections：a role for antigen presentation beyond lymphoid organs?[J].Curr Opin Immunol,2011;23(1)：124-130.

10 Iijima N,Linehan MM,Zamora Met al.Dendritic cells and B cells maximize mucosal Th1 memory response to herpes simplex virus[J].J Exp Med,2008;205(13)：3041-3052.

11 Singh S K,Streng-Ouwehand I,Litjens Met al.Design of neo-glycoconjugates that target the mannose receptor and enhance T LR-independent cross-presentation and Th1 polarization[J].Eur J Immunol,2011;41(4)：916-925.

12 李 杰,石 瑋,邊海霞 et al.負載滅活口蹄疫病毒樹突狀細胞對CD8+T細胞的旁位活化效應[J].中國免疫學雜志,2009;25(8)：721-726.

13 Guzman E,Taylor G,Charleston Bet al.Induction of a cross-reactive CD8(+)Tcell response followingfoot-and-mouth disease virus vaccination[J].J Virol,2010;84(23)：12375-12384.

14 王家鑫,石 瑋,邊海霞 et al.樹突狀細胞對滅活口蹄疫病毒的泛素化作用[J].中國獸醫(yī)科學,2008;38(11)：929-932.

15 張 麗,石 瑋,張 雷 et al.負載滅活口蹄疫病毒樹突狀細胞啟動的CD4+T細胞應答[J].中國獸醫(yī)科學,2011;41(7)：712-716.

16 Bousso P,Robey E.Dynamics of CD8+T cell priming by dendritic cells in intact lymph nodes[J].Nat Immunol,2003;4(6)：579-585.