何慶，徐迎波，王程輝，田振鋒，朱棟梁

安徽中煙工業(yè)公司技術(shù)中心，合肥市高新區(qū)天達(dá)路9號(hào)230088

新煙堿類殺蟲劑是一類高效、安全、高選擇性的新型殺蟲劑，作為后突觸煙堿乙酰膽堿受體（nAChRs）的激動(dòng)劑作用于昆蟲中樞神經(jīng)系統(tǒng)［1］，具有高殺蟲活性，而對(duì)哺乳動(dòng)物低毒，在國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)的銷量發(fā)展很快。據(jù)預(yù)測(cè)，今后5年內(nèi)，新煙堿類殺蟲劑將占全球農(nóng)藥總量的15%～20%。其中，“烯啶蟲胺”、“吡蟲啉”和“啶蟲咪”（圖1）均是1990s年代日本開發(fā)出來的，目前國(guó)內(nèi)已有企業(yè)生產(chǎn)。而“噻蟲啉”和“噻蟲嗪”自2001年注冊(cè)使用，目前均在專利保護(hù)期內(nèi)。此類殺蟲劑單一殘留量的檢測(cè)方法已有報(bào)道，如Navalon等［2］采用GC/MS測(cè)定蔬菜殘留“吡蟲啉”，Tokieda等［3］利用GC連接電子捕獲檢測(cè)器檢測(cè)“啶蟲咪”含量。采用GC方法均會(huì)涉及到水解或者氧化的前處理過程，實(shí)驗(yàn)較為繁瑣。Sasaki等［4］指出，由于基質(zhì)效應(yīng)的存在，利用GC檢測(cè)農(nóng)藥殘留往往會(huì)得到過高的結(jié)果。人們逐漸發(fā)現(xiàn)，液相色譜（LC）法更適合于此類殺蟲劑的檢測(cè)，如Fernandez-Alba等［5］采用HPLC-UV測(cè)定蔬果中“吡蟲啉”殘留，并用LC-MS證實(shí)了其準(zhǔn)確性，韓振泰等［6］利用反向HPLC測(cè)定了“噻蟲啉”殘留，此方法也被用于“噻蟲嗪”含量的檢測(cè)［7-8］。然而，這些方法均需要二氯甲烷或者氯仿為萃取溶劑，對(duì)環(huán)境不友好。因此，進(jìn)行了本研究，旨在建立一種同時(shí)檢測(cè)煙草中5種新煙堿類殺蟲劑（圖1）殘留的方法，也為其他食品中此類殺蟲劑的檢測(cè)提供參考。

圖15 種新煙堿類殺蟲劑結(jié)構(gòu)式

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

甲醇（色譜純，美國(guó)Tedia公司）；醋酸銨（AR，上海試劑廠）；超純水；“啶蟲咪”標(biāo)樣（純度99%，德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司）；“烯啶蟲胺”、“吡蟲啉”、“噻蟲嗪”、“噻蟲啉”（標(biāo)樣，純度99.5%，美國(guó)AccuStandard公司）；無(wú)農(nóng)藥殘留的空白煙葉樣品（取自中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)煙草實(shí)驗(yàn)基地溫室中以蛭石為基質(zhì)的盆缽中種植的K326煙株）。

4000 Q Trap質(zhì)譜儀（美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）；Waters Acquity超高壓液相色譜儀（UPLC，美國(guó)Waters公司）；Milli-Q超純水儀（美國(guó)Millipore公司）；RE-2000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；JK-250B超聲波清洗器（合肥金尼克機(jī)械制造有限公司）；Cleanert Pesticarb SPE柱（500 mg/6 mL，天津博納艾杰爾科技有限公司）；Supelclean Envi-18 SPE柱、Supelclean Envi-Chrom P SPE柱（500 mg/6 mL，美國(guó)Supelco公司）；SampliQ Silica SPE柱（500 mg/6 mL，美國(guó)Agilent公司）；AL204-IC電子天平（感量：0.0001 g，瑞士梅特勒-托利多公司）。

1.2 樣品處理［9］與分析［10］

準(zhǔn)確稱取5.0 g煙末樣品，置于50 mL三角瓶中，加入20 mL 20%甲醇水溶液，室溫下超聲萃取10 min，過濾，用5 mL 20%甲醇水溶液洗滌濾渣和濾紙，液洗滌與濾液合并，共25 mL。取10 mL濾液，傾入Cleanert Pesticarb SPE柱上，緩慢施壓逐滴滴下，流盡后，流出液舍棄，用30 mL甲醇洗脫，收集洗脫液，40℃，9.81 kPa下旋蒸至近干，N2吹干，用無(wú)水甲醇溶解并定容至1 mL，過0.22 μm微孔濾膜，濾液進(jìn)行LC-MS/MS分析。采用比較與標(biāo)樣色譜峰保留時(shí)間定性，外標(biāo)工作曲線定量。測(cè)定條件為：

色譜柱：Waters Acquity UPLC Ben C18柱（2.1 mm×50 mm i.d.，1.7 μm d.f.）；柱溫：25℃；流動(dòng)相：甲醇（A）和0.1%醋酸銨水溶液（B）；流速：0.6 mL/min；梯度洗脫：5%A+95%（0～3 min），40%A+60%B（3～10 min），60%A+40%B（10～15 min），100%A（15～20 min）；進(jìn)樣量：10μL。

電離模式：電噴霧（ESI）正離子模式；電噴霧電壓：3000 V；檢測(cè)模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM，表1）；離子源溫度：550℃；掃描時(shí)間：100 ms。

2 結(jié)果與討論

2.1 SPE條件的選擇

固相萃?。⊿PE）被廣泛應(yīng)用于農(nóng)藥及其共萃物的分離［11-12］。以往的SPE方法中，一般先用水溶性溶劑萃取，萃取液濃縮后再進(jìn)行SPE，較為費(fèi)時(shí)。Carbras。等［13］分析低酒精含量的溶液如白酒中的殺蟲劑時(shí)，建立了一種樣品不經(jīng)濃縮直接SPE的方法。這也表明，如果SPE柱對(duì)被分析物的吸附能力足夠大，只要在萃取溶劑中降低有機(jī)溶劑的含量，就可以在保證萃取效率的同時(shí)，增大SPE柱對(duì)這5種殺蟲劑的保留能力，然后利用強(qiáng)極性溶劑將其洗脫［14］，這樣可以省去萃取液濃縮步驟，直接上樣。基于此種考慮，本研究比較了不同甲醇濃度水溶液的萃取效率，萃取液不經(jīng)過濃縮，直接進(jìn)行SPE，通過5種殺蟲劑回收率的檢測(cè)，同時(shí)也比較了4種類型SPE柱，分別為Silica硅膠柱、Pesticarb石墨化碳柱、C18柱，以及Envi-Chrom P聚苯乙烯二乙烯基苯柱對(duì)這5種新煙堿類殺蟲劑的保留能力，結(jié)果見表1。從表1可以看出，石墨化碳柱和聚合物柱對(duì)這5種殺蟲劑的保留能力均強(qiáng)于C18柱，硅膠柱的保留能力最弱。這與Kaufmann的結(jié)論一致［15］，Kaufmann認(rèn)為，農(nóng)殘分析時(shí)，石墨化碳或者聚合物柱的純化效果比C18和C8柱要好，聚合物柱不適合于“烯啶蟲胺”的分析。因此，選擇20%甲醇水溶液作萃取劑，CleanertPesticarb石墨化碳柱作SPE柱。而后，比較了不同體積甲醇對(duì)這5種新煙堿類殺蟲劑的洗脫效率，結(jié)果見表2。由表2看出，30 mL甲醇既可以將這5種殺蟲劑全部洗脫，而且洗脫液濃縮后顏色為無(wú)色至淡黃，避免了煙草色素對(duì)液相色譜柱的污染。

表1 不同甲醇濃度萃取劑、SPE柱類的5種新煙堿類殺蟲劑的回收率①（%）

表2 不同體積甲醇洗脫劑的5種新煙堿類殺蟲劑回收率（%）

2.2 LC-MS/MS條件的確定

石隆平等［10］在分析“烯啶蟲胺”原藥純度時(shí)，選擇流動(dòng)相甲醇和水梯度洗脫：100%水20 min內(nèi)至50%甲醇和50%水，將“烯啶蟲胺”與雜質(zhì)分離。吳培等［16］發(fā)現(xiàn)，采用40%甲醇和60%水可使烯啶蟲胺分離。而曹愛華等［9］發(fā)現(xiàn)，采用甲醇/水（60/40）作流動(dòng)相，可使“吡蟲啉”良好分離。本實(shí)驗(yàn)最初選擇由少量甲醇（5%）組成流動(dòng)相，縮短了“烯啶蟲胺”的出峰時(shí)間，梯度洗脫至40%甲醇，可使“烯啶蟲胺”的完全分離。梯度洗脫至60%甲醇，“吡蟲啉”，“啶蟲咪”，“噻蟲啉”和“噻蟲嗪”得到完全分離（圖2），而醋酸銨的加入，有利于樣品的正離子化效率［17］。

圖2 混合標(biāo)準(zhǔn)樣品的MRM圖

質(zhì)譜采用多反應(yīng)檢測(cè)模式（MRM），實(shí)驗(yàn)確定［M+1］+為母離子，以手動(dòng)進(jìn)樣選擇監(jiān)測(cè)離子對(duì)，確定2對(duì)離子對(duì)作為每種殺蟲劑監(jiān)測(cè)離子對(duì)，1對(duì)為定量離子對(duì)，1對(duì)為輔助定性離子對(duì)，分別對(duì)各離子對(duì)離子化以及質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果見表3。

表3 5種新煙堿類殺蟲劑的MRM參數(shù)①

2.3 工作曲線與檢測(cè)限

準(zhǔn)確稱量“烯啶蟲胺”、“噻蟲嗪”、“吡蟲啉”、“啶蟲咪”和“噻蟲啉”各10 mg，分別置于5個(gè)100 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，得濃度100 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。移取“烯啶蟲胺”、“噻蟲嗪”、“吡蟲啉”、“啶蟲咪”和“噻蟲啉”的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液各10 mL，傾于同一只100 mL容量瓶中，用甲醇定容，得濃度為10 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，同樣方法得到濃度為5.0，2.0，1.0，0.5和0.1 μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。將6個(gè)濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液按濃度由低到高的順序進(jìn)樣進(jìn)行LC-MS/MS分析，并以峰面積（y）對(duì)其相應(yīng)濃度（x，μg/mL）進(jìn)行線性回歸分析，得到各組分的工作曲線回歸方程及相關(guān)系數(shù)（表4）。取最低濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，連續(xù)進(jìn)樣10次，并計(jì)算這些數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD），以3倍SD和10倍SD分別作為儀器的檢測(cè)限和定量限，結(jié)果見表4。可以看出，在設(shè)定0.1～10 μg/mL濃度范圍內(nèi)，5種殺蟲劑線性關(guān)系良好，適合于定量分析。

2.4 回收率與重復(fù)性

取2份（5 g/份）無(wú)農(nóng)藥殘留的空白煙葉樣品中分別添加0.10和1.00 mg/kg的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后用本方法測(cè)定各組分含量，并根據(jù)測(cè)定量和加標(biāo)量計(jì)算回收率，結(jié)果見表5。由表5可以看出，在0.10和1.00 mg/kg添加水平下，5種殺蟲劑的回收率在80%～92%之間。3次平行測(cè)定，5種殺蟲劑的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為2.58%，2.50%，3.83%，2.59%，4.08%，說明本方法準(zhǔn)確度和重復(fù)性均達(dá)到了農(nóng)殘分析的要求。

表4 標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢測(cè)限

表5 5種殺蟲劑的回收率（%）

3 結(jié)論

建立了一種甲醇水溶液萃取，Pesticarb石墨化碳柱凈化，LC-MS/MS同時(shí)檢測(cè)煙葉5種新煙堿類殺蟲劑的方法。本方法操作簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確性和重復(fù)性均較好，適合于煙葉中新煙堿類殺蟲劑的殘留分析。

［1］賈俊超，苑建勛，范志金.新煙堿類殺蟲劑選擇作用的分子機(jī)理［J］.農(nóng)藥，2007，46（4）：227-231，234.

［2］Navalón A，González-Casaoo A，El-Khattabi R，et al.Determination of imidacloprid in vegetable samples by gas chromatography-mass spectrometry［J］.Analyst，1997，122：579-581.

［3］Tokieda M，Ozawa M,Kobayashi S，et al.Method to determination of total residues of the insecticide acetamiprid and its metabolites in crops by gas chromatography［J］.J Pestic Sci，1997，22：78-83.

［4］Sasaki K，Nakamura Y，Ninomiya T，et al.Application of the bulletin method for rapid analysis of pesticide residues on the analysis of 10 pesticides notified in 1997［J］.J Food Hyg Soc Jpn，1998，39：448-452.

［5］Fernandez-Alba A R，Valver A，Aguera A，et al.Determination of imidacloprid in vegetables by highperformance liquid chromatography with diode-array detection［J］.J Chromatogr A，1996，721：97-105.

［6］韓振泰，李如華，高瑞桐.反相高效液相色譜法測(cè)定絨毛白蠟中噻蟲啉殘留量［J］.現(xiàn)代科學(xué)儀器，2007，17（1）：64-65.

［7］曾得意，王鳴華.噻蟲嗪的反相高效液相色譜分析［J］.農(nóng)藥，2005，44（10）：469-470.

［8］湯富彬，陳宗懋，羅逢健，等.HPLC法測(cè)定黃瓜和土壤中噻蟲嗪的殘留量［J］.農(nóng)藥，2007，46（5）：335-337.

［9］曹愛華，李義強(qiáng)，徐光軍，等.高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定煙草中吡蟲啉多菌靈甲基硫菌靈的殘留量［J］.中國(guó)煙草科學(xué)，2009，30（1）：31-34

［10］石隆平，王吉順，于榮，等.烯啶蟲胺原藥及其雜質(zhì)液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法分析研究［J］.農(nóng)藥科學(xué)與管理，2011，32（2）：42-44

［11］Herrera A，Pérez Arquillué C，Conchello P，et a1.Determination of pesticides and PCBs in honey by solid-phase extraction cleanup followed by gas chromatography with electron-capture and nitrogen phosphorus detection［J］.Anal Bioanal Chem，2005，381：695-701.

［12］單菊菊，程新勝，黃蘭.固相萃取-高效液相色譜法測(cè)定煙葉中的“吡蚜酮”殘留量［J］.煙草科技，2010（5）：38-41.

［13］Cabras P，Tubberoso C，Melis M，et al.Multiresidue method for pesticide determination in wine by high-performanceliquid chromatography［J］.J Agric Food Chem，1992，40：817-819.

［14］Iijima K，Saka M，Odanaka Y，et al.Multiresidue analytical method of pesticides by GC-MS：Application of macro-porous diatomaceous earth column and silica gel cartridge［J］.J Pestic Sci，1997，22：17-26.

［15］Kaufmann A.Fully automated determination of pesticides in wine［J］.J AOAC Int，1997，80：1302-1307.

［16］吳培，林波，劉敬民.烯啶蟲胺原藥的高效液相色譜分析［J］.農(nóng)藥，2008，47（6）：4345-435.

［17］Yu K，Krol J，Balogh M.A fully automated LC/MS method development and quantification protocol targeting 52 carbamates，thiocarbamates，and phenylureas［J］.Anal Chem，2003，75：4103-4112.