張志勇，王艷偉，楊光參

(溫州大學物理與電子信息工程學院，浙江溫州 325035)

質(zhì)粒pBR322DNA與內(nèi)切酶EcoRI相互作用的研究

張志勇，王艷偉，楊光參?

(溫州大學物理與電子信息工程學院，浙江溫州 325035)

借助原子力顯微鏡（AFM）對DNA與內(nèi)切酶的切割與結(jié)合作用進行研究．當緩沖液中有Mg2+存在時，內(nèi)切酶EcoRI會在單一識別位點處切割pBR322DNA，如果緩沖液中的Mg2+用Ca2+代替，內(nèi)切酶EcoRI則會與pBR322DNA在單一識別位點處結(jié)合，并且切割率與結(jié)合率都隨著內(nèi)切酶濃度的增加而增加．

DNA；內(nèi)切酶；切割；結(jié)合

DNA是生物體的遺傳物質(zhì)，同時也是染色體的主要組成部分[1-2]．限制性內(nèi)切酶是生物學中廣為使用的一種工具酶，能使多核苷酸鏈發(fā)生斷裂，但是它只對脫氧核糖核酸內(nèi)的一定堿基序列中的某一特定位置發(fā)生作用，把這個特定位置的鏈切開，所以通過內(nèi)切酶可以將某一個遺傳基因給切下來[3-5]．如果再將這一基因連在其它細胞遺傳基因上，組成新細胞，則該新細胞會具有新的遺傳特性與功能．因此，限制性內(nèi)切酶的存在使DNA分子之間的重組成為了可能．

DNA與內(nèi)切酶的相互作用在生物學中有重要意義．DNA與蛋白質(zhì)分子相結(jié)合的精確位點圖譜和不同細胞狀態(tài)下結(jié)合位點的測定對研究復(fù)雜細胞體系的機理與功能,特別是基因表達的控制是十分關(guān)鍵的．原子力顯微鏡（AFM）高度分辨率可達0.1 nm，寬度分辨率可達2 nm，已廣泛用于表征各種DNA與蛋白質(zhì)的復(fù)合物．原子力顯微鏡中，云母是研究DNA構(gòu)象變化和DNA-蛋白質(zhì)相互作用的常見基底[6-7]，其表面具有原子級別的平整度，而且?guī)в胸撾姾?，有利于吸附在表面的核酸的處理，這也是原子力顯微鏡廣泛應(yīng)用于納米生物科學研究的重要原因[8-9]．

帶負電的云母表面與帶負電的磷酸根骨架間有天然的排斥作用，為了消除這種作用，常在沉積緩沖液中加入二價離子[10-11]或者三價離子[12]．1983年，Terry等人[13]研究了控制EcoRI與DNA特異性作用與非特異性作用的熱動力學系數(shù)，1986年，McClarin等人[14]確定了EcoRI與DNA作用復(fù)合物的具體結(jié)構(gòu)，1999年，Wright[15]等人又進一步提出了EcoRI與DNA結(jié)合與分離的動力學機制，這些研究結(jié)果為進一步在云母片上面研究DNA與內(nèi)切酶的相互作用提供了主要依據(jù)．

EcoRI是一種小的內(nèi)切酶（31KDa），通過二聚體的形式與DNA發(fā)生作用，其識別序列是5’-GAATTC-3’[16]．本文利用AFM對內(nèi)切酶EcoRI與質(zhì)粒pBR322DNA的相互作用進行研究．結(jié)果表明，內(nèi)切酶EcoRI與質(zhì)粒pBR322DNA有單一的識別位點，有酶輔助因子鎂離子存在于緩沖液中時，內(nèi)切酶會對DNA有切割作用，如果緩沖液中的鎂離子用鈣離子代替，那么內(nèi)切酶的切割作用會被限制，蛋白反而會與DNA結(jié)合，并且切割率與結(jié)合率都隨著內(nèi)切酶濃度的增加而增加．

1 材料與方法

1.1 材 料

PBR322DNA（4632bp，環(huán)狀）購于NEB（北京）公司，原始濃度是500 ng·μL-1．內(nèi)切酶EcoRI購買于sigma（美國）公司，原始濃度是5 unit·μL-1．氯化鎂與氯化鈣等化學試劑都是分析純，購于北京經(jīng)科宏達公司．實驗用水都是超純水（經(jīng)密理博超純水系統(tǒng)過濾、去離子化處理）．云母做成1 cm × 1 cm的正方形，每次用前都用透明膠重新解離，以保證云母片表面的平整度與清潔．

1.2 AFM成像

本文使用的AFM是日本京都島津公司生產(chǎn)的，型號為SPM-9600．文中所有圖像都是在空氣中采用輕敲模式獲得的，掃描速度都是3 Hz，圖片像素都是512 × 512．AFM圖像中關(guān)于DNA高度、寬度等信息的分析都是從SPM-9600自帶的離線分析軟件獲得的．

1.3 AFM樣品準備

1）用移液器量取200 μL緩沖液（20 mmol·L-1Tris-HCl、50 mmol·L-1NaCl、10 mmol·L-1MgCl2·6H2O或者20 mmol·L-1Tris-HCl、50 mmol·L-1NaCl、10 mmol·L-1CaCl2·6H2O）放入離心管中，貼上標簽．向緩沖液中加入0.5 μL的λ-DNA（500 ng·μL-1）與不同量的EcoRI（5 unit·μL-1）內(nèi)切酶輕彈混勻．再將離心管置于37℃的干式恒溫箱內(nèi)放置30分鐘．

2）用移液器吸取20 μL離心管中的混合液，滴在已經(jīng)處理過的云母片上，蓋上玻璃罩，防止灰塵落入影響成像的效果，沉積2分鐘（使用計時器計時）．沉積2分鐘后用超純凈水洗滌云母表面的樣品，用移液器吸取超純凈水，從云母片的一端滴，再從云母片的另一端吸，在洗滌過程中，移液器的槍頭不要觸碰云母片，以防破壞云母片，不利于觀察，此過程重復(fù)10 – 15次．接著用氮氣將樣品吹干，在吹的過程中吹的方向與洗滌的方向保持一致．

3）用以上的步驟制作多個樣品，樣品按照順序標記好，記錄每個樣品的具體時間與條件．最后將樣品放在玻璃皿中，在室溫干燥箱內(nèi)干燥2個小時以上．將制好樣品放于AFM下觀察成像．

2 結(jié)果與討論

2.1 內(nèi)切酶與DNA的切割作用

有關(guān)內(nèi)切酶與DNA作用的研究與討論很多，大多數(shù)內(nèi)切酶與DNA的相互作用都需要Mg2+作為催化輔助因子[17-19]．有鎂離子存在時，內(nèi)切酶具有很大的切割活性，內(nèi)切酶會識別DNA4-8堿基對的特異序列，然后在這個識別位點上或者附近切割 DNA[20-22]．本文利用 AFM 對內(nèi)切酶EcoRI與質(zhì)粒pBR322DNA的相互作用進行研究，用含有Mg2+的緩沖液實驗，實驗結(jié)果如圖1所示，環(huán)狀的DNA被切開，變成線狀結(jié)構(gòu)，并且只有一個斷口．從圖1還可以看出，隨著內(nèi)切酶濃度的增加，DNA被切割的數(shù)目也在增加．

從切割后不同DNA結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計圖（圖1的D、E、F）可以看出，剛開始內(nèi)切酶濃度較小時，內(nèi)切酶濃度增加對切割率的影響不是很大，當內(nèi)切酶的濃度大于5 unit·μL-1時，DNA被切割的比例明顯增加．

圖1 有Mg2+存在的條件時, 內(nèi)切酶EcoRI與DNA的切割作用圖

2.2 內(nèi)切酶與DNA的結(jié)合作用

用含有Ca2+的緩沖液代替Mg2+緩沖液進行實驗，實驗結(jié)果如圖2所示．從圖2中可以清晰看見DNA上面有結(jié)合的內(nèi)切酶，并且內(nèi)切酶的濃度越大，其與DNA的結(jié)合率越高．內(nèi)切酶的濃度比較低時，DNA上面的內(nèi)切酶很少，只有個別DNA上面有一個結(jié)合的內(nèi)切酶，隨著內(nèi)切酶濃度的增加，每個DNA上面幾乎都有結(jié)合的內(nèi)切酶酶，而且不止一個（這是由一些非特異性的結(jié)合導(dǎo)致的，不止在識別位點與DNA結(jié)合），甚至當內(nèi)切酶的個數(shù)多到一定程度，DNA之間因為內(nèi)切酶的作用會發(fā)生交聯(lián)，或者凝聚．由此可見，有Ca2+存在時，內(nèi)切酶的切割作用被限制，內(nèi)切酶與DNA的特異性識別位點有結(jié)合作用．與濃度對切割率的影響不同，剛開始內(nèi)切酶濃度較小時，內(nèi)切酶濃度增加對結(jié)合率的影響就很大，在內(nèi)切酶的整個實驗濃度范圍內(nèi)，結(jié)合率都在隨內(nèi)切酶濃度的增加而快速增加．有鈣離子存在時，內(nèi)切酶可以結(jié)合到DNA的特定位點，這在基礎(chǔ)生物化學中有重要意義．

內(nèi)切酶與DNA的特異性識別位點有結(jié)合作用，是因為有Ca2+存在時，內(nèi)切酶與DNA作用會產(chǎn)生特異性蛋白-金屬-DNA復(fù)合物[20-22]，這種穩(wěn)定的三元復(fù)合物會阻礙內(nèi)切酶對DNA的切割作用，增加兩者的結(jié)合性．

圖2 有Ca2+存在時, 內(nèi)切酶EcoRI與DNA的結(jié)合作用圖

3 結(jié) 論

內(nèi)切酶EcoRI與質(zhì)粒pBR322DNA的相互作用主要有兩種，它們之間有單一的特異性識別位點．在有酶輔助因子鎂離子存在時，內(nèi)切酶對DNA有切割作用，環(huán)狀DNA被切成線狀，而且只有一個斷口；如果用鈣離子代替鎂離子實驗，內(nèi)切酶的切割作用就會被限制，蛋白會在識別位點處與DNA結(jié)合，一根DNA上面會結(jié)合一個內(nèi)切酶的二聚體．內(nèi)切酶EcoRI與質(zhì)粒pBR322DNA的結(jié)合率與切割率都隨內(nèi)切酶的濃度增加而增加，結(jié)合率增加的速度更快一些．

[1] Watson J D, Crick F. The structure of DNA [J]. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology, 1953, 18: 123-124.

[2] Dulbecco R. A turning point in cancer research: sequencing the human genome [J]. Science, 1986, 231(4742): 1055-1056.

[3] Kuspa A, Loomis W F. Tagging developmental genes in Dictyostelium by restriction enzyme-mediated integration of plasmid DNA [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1992, 89: 8803-8807.

[4] Smith H O, Birnstiel M L. A simple method for DNA restriction site mapping [J]. Nucleic acids research, 1976, 3: 2387-2398.

[5] Nathans D, Smith H O. Restriction endonucleases in the analysis and restructuring of DNA molecules [J]. Annual review of biochemistry, 1975, 44(1): 273-293.

[6] Hamon L, Pastré D, Dupaigne P, et al. High-resolution AFM imaging of single-stranded DNA-binding (SSB) protein-DNA complexes [J]. Nucleic acids research, 2007, DOI: 10.1093/nar/gkm147.

[7] Sorel I, Piétrement O, Hamon L, et al. The EcoRI-DNA Complex as a Model for Investigating Protein-DNA Interactions by Atomic Force Microscopy [J]. Biochemistry, 2006, 45: 14675-14682.

[8] Oh S J, Hong B J, Choi K Y, et al. Surface modification for DNA and protein microarrays [J]. OMICS: A journal of Integrative Biology, 2006, 10(3): 327-343.

[9] Liu Q, Wang L, Frutos A G, et al. DNA computing on surfaces [J]. Nature, 2000, 403(6766): 175-179.

[10] Pastré D, Piétrement O, Fusil S, et al. Adsorption of DNA to mica mediated by divalent counterions: a theoretical and experimental study [J]. Biophysical journal, 2003, 85(4): 2507-2518.

[11] Rivetti C, Guthold M, Bustamante C. Scanning Force Microscopy of DNA Deposited onto Mica: Equilibration versus Kinetic Trapping Studied by Statistical Polymer Chain Analysis [J]. Journal of molecular biology, 1996, 264(5): 919-932.

[12] Pastré D, Hamon L, Landousy F, et al. Anionic polyelectrolyte adsorption on mica mediated by multivalent cations: a solution to DNA imaging by atomic force microscopy under high ionic strengths [J]. Langmuir, 2006, 22(15): 6651-6660.

[13] Terry B, Jack W, Rubin R. et al. Thermodynamic parameters governing interaction of EcoRI endonuclease with specific and nonspecific DNA sequences [J]. Journal of Biological Chemistry, 1983, 258(16): 9820-9825.

[14] McClarin J A, Frederick C A, Wang B C, et al. Structure of the DNA-Eco RI endonuclease recognition complex at 3 A resolution [J]. Science, 1986, 234(4783): 1526-1541.

[15] Wright D J, Jack W E, Modrich P. The kinetic mechanism of EcoRI endonuclease [J]. Journal of Biological Chemistry 1999, 274(45): 31896-31902.

[16] Allison D, Kerper P, Doktycz M, et al. Direct atomic force microscope imaging of EcoRI endonuclease site specifically bound to plasmid DNA molecules [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1996, 93(17): 8826-8829.

[17] Brautigam C A, Steitz T A. Structural and functional insights provided by crystal structures of DNA polymerases and their substrate complexes [J]. Current Opinion in Structural Biology, 1998, 8: 54-63.

[18] Galburt E A, Stoddard B L. Catalytic mechanisms of restriction and homing endonucleases [J]. Biochemistry, 2002, 41: 13851-13860.

[19] Yang W, Lee J, Nowotny M. Making and breaking nucleic acids: two-Mg2+-ion catalysis and substrate specificity [J]. Molecular Cell, 2006, 22: 5-13.

[20] Roberts R J, Halford S E. Type II restriction enzymes [C] // Linn S M, Lloyd R S, Roberts R J. Nucleases. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1993: 35-88.

[21] Aggarwal A K. Structure and function of restriction endonucleases [J]. Current Opinion in Structural Biology, 1995, 5: 11-19.

[22] Perona J J. Type II restriction endonucleases [J]. Methods, 2002, 28: 353-364.

Study on Interaction between Plasmid pBR322DNA and Endonuclease EcoRI

ZHANG Zhiyong, WANG Yanwei, YANG Guangcan
(College of Physics and Electronic Information Engineering, Wenzhou University, Wenzhou, China, 325035)

The interaction of cleaving and binding between DNA and endonucleases EcoRI was observed by atomic force microscope (AFM). The findings showed that in the presence of Mg2+in buffer, endonucleases EcoRI can cleave pBR322DNA on one specific recognition site; while, if Ca2+took the place of Mg2+in buffer, endonucleases EcoRI can bind pBR322DNA on the specific recognition site. The cleaving and binding ratio would increase with the increase of concentration of endonucleases.

DNA; Endonuclease; Cleaving; Binding

(編輯：王一芳)

Q633

A

1674-3563(2011)05-0032-06

10.3875/j.issn.1674-3563.2011.05.006 本文的PDF文件可以從xuebao.wzu.edu.cn獲得

2011-03-29

國家重點基礎(chǔ)研究項目(2007CB935900)；國家自然科學基金(10974146, 20934004)；浙江省自然科學基金(Y6090222)

張志勇(1980- )，男，湖南寧遠人，碩士研究生，研究方向：生物物理．? 通訊作者，yanggc@wzu.edu.cn