吳 瓊， 楊春華， 劉靜涵， 秦民堅(jiān)*

(1.中國(guó)藥科大學(xué)中藥資源教研室，江蘇 南京210009;2.中國(guó)藥科大學(xué)天然藥物化學(xué)教研室，江蘇南京210009;3.中國(guó)藥科大學(xué)分析測(cè)試中心，江蘇南京210009;4.教育部藥物質(zhì)量與安全預(yù)警重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京210009)

關(guān)白附為毛茛科烏頭屬植物黃花烏頭(Aconitum coreanum(Lèvl)Rapaics)的塊根，為常用中藥，具有祛風(fēng)、燥濕、化痰、止痛等功效。其主要活性成分為二萜生物堿，迄今已分離得到其中28個(gè)二萜生物堿，包括25個(gè)C20和3個(gè)C19二萜生物堿，其中關(guān)附甲素(GFA，1)為叔胺類C20Hetisine型二萜生物堿，有抗多種實(shí)驗(yàn)性心率失常作用，并已進(jìn)入我國(guó)一類新藥的Ⅳ期臨床實(shí)驗(yàn)［1-4］;關(guān)附壬素(GFI，2)為其另一含量較高的二萜生物堿，與GFA相比，具有相同的母核，但?；鶖?shù)目較少，活性較弱［5-6］;關(guān)附辛素(GFH，3)為水溶性Atisine型生物堿，又名atisine chloride［7］，能抑制骨骼肌系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)，具高毒性，對(duì)小鼠的LD50為9.0 mg·kg-1［8］，且其在關(guān)白附藥材中含量較高，是藥材質(zhì)量控制的指標(biāo)性成分之一。本文首次采用反相高效液相色譜法同時(shí)對(duì)關(guān)白附中3種生物堿——GFA、GFI和GFH進(jìn)行含量測(cè)定，獲得滿意結(jié)果，為藥材質(zhì)量控制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與材料

Agilent 1100 system(G1311A四元梯度泵，G1313A自動(dòng)進(jìn)樣器，G1315B-DAD二極管陣列檢測(cè)器，Agilent公司);Agilent色譜工作站;AE240分析天平(METTLER公司);0412-1離心機(jī)(上海手術(shù)器械廠);KQ-250DE型醫(yī)用數(shù)控超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司);RT-02藥材粉碎機(jī)(浙江武義屹立工具有限公司)。

乙腈(色譜純，Merck公司);磷酸，三乙胺(分析純，南京化學(xué)試劑廠);純凈水(樂(lè)百氏公司);GFA、GFI、GFH對(duì)照品(自制，結(jié)構(gòu)經(jīng)UV、IR、NMR、MS鑒定，純度經(jīng)HPLC峰面積歸一化法測(cè)得大于98%)。

關(guān)白附藥材樣品(批號(hào)0701～0705，為2007年10月中旬采收的3年生藥材;批號(hào)0801～0805，為2008年10月中旬采收的2年生藥材)，由吉林敖東洮南藥業(yè)提供，中國(guó)藥科大學(xué)中藥學(xué)院秦民堅(jiān)教授鑒定為毛茛科烏頭屬植物黃花烏頭的塊根。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱:Zorbax Eclipse XDB-C8柱(2.1 mm×150 mm，5μm);流動(dòng)相A:0.2%庚烷磺酸鈉緩沖液(加入0.2%三乙胺，磷酸調(diào)至pH 3)，流動(dòng)相B:乙腈;梯度洗脫:流動(dòng)相B體積分?jǐn)?shù)在0～10 min時(shí)為10%，10～25 min時(shí)為10%～17%，25～60 min時(shí)為32%;流速:0.2 mL·min-1;檢測(cè)波長(zhǎng):205 nm;柱溫:25℃;進(jìn)樣量:10μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取對(duì)照品GFI 24.8 mg、GFA 25.2 mg、GFH 25.0 mg，分別置50 mL量瓶?jī)?nèi)，用流動(dòng)相A溶解并定容，搖勻，制得GFI(0.496 g·L-1)、GFA(0.504 g·L-1)和GFH (0.500 g·L-1)的對(duì)照品儲(chǔ)備液。取對(duì)照品 GFI儲(chǔ)備液2.5 mL、GFA儲(chǔ)備液2.5 mL和GFH儲(chǔ)備液5.0 mL，分別置5 mL量瓶中，加流動(dòng)相A稀釋，即得GFI(0.248 g·L-1)、GFA(0.252 g·L-1)和GFH(0.500 g·L-1)的對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取關(guān)白附藥材樣品粉末約2 g，過(guò)24目篩(孔徑為0.8 mm)，精密稱重，加入50 mL 1%HCl，稱重，80 Hz超聲30分鐘，放冷，加入1%HCl補(bǔ)足失重，搖勻，移取4 mL置離心管，離心(4 000 r·min-1)30 min，移取上清液，過(guò)0.45μm微孔濾膜，即得。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，取供試品溶液，進(jìn)樣，記錄色譜圖(見(jiàn)圖1)。結(jié)果測(cè)得，理論塔板數(shù)以GFI計(jì)不低于10000;3種生物堿色譜峰的對(duì)稱因子在0.95～1.05之間，其相鄰色譜峰的分離度大于1.5。

圖1 供試品溶液色譜圖Figure 1 Chromatogram of sample solution

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系考察 精密量取各對(duì)照品儲(chǔ)備液2、4、6、8、10 mL，分別置10 mL量瓶中，以流動(dòng)相A稀釋定容，制成系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)樣，記錄色譜圖。以峰面積(A)為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度(C)為橫坐標(biāo)，進(jìn)行回歸計(jì)算，分別得GFI、GFA和GFH的回歸方程: AGFI=5.0×103C+1.8×102(r=0.999 9)，AGFA= 4.0×103C-1.5×102(r=0.999 9)，AGFH=8.2×103C-3.7×102(r=1.000);其質(zhì)量濃度線性范圍分別為:0.100～0.502 g·L-1，0.100～0.498 g·L-1，0.100～0.500 g·L-1。

2.4.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批次關(guān)白附藥材樣品(批號(hào):0805)6份，分別按“2.2.2”項(xiàng)下操作，制成供試品溶液，進(jìn)樣，記錄色譜圖。結(jié)果測(cè)得，關(guān)白附藥材中GFI、GFA和GFH含量的RSD(n=6)分別為1.20%、1.85%和1.41%，其保留時(shí)間的RSD(n= 6)均小于0.5%。表明此方法重復(fù)性良好。

2.4.3 精密度試驗(yàn) 取關(guān)白附藥材樣品(批號(hào): 0801)1份，同法制成供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖。結(jié)果測(cè)得，關(guān)白附藥材中GFI、GFA和GFH含量的RSD(n=6)分別為0.11%、0.23%和 0.14%，其保留時(shí)間的RSD(n=6)均小于0.5%。表明此方法精密度良好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取關(guān)白附藥材樣品(批號(hào): 0801)1份，同法制成供試品溶液，分別在室溫放置0、6、12、18、24 h時(shí)，進(jìn)樣，記錄色譜圖。結(jié)果測(cè)得，在不同時(shí)間點(diǎn)的GFI、GFA和GFH峰面積的RSD (n=5)分別為0.42%、1.27%和0.18%，其保留時(shí)間的RSD(n=5)均小于0.5%。表明供試品溶液在室溫放置24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.5 回收率試驗(yàn) 取已知含量的同一批次關(guān)白附藥材樣品(批號(hào):0702)約1 g，共9份，精密稱定，每3份樣品中分別加入混合對(duì)照品溶液［含GFI(4.75 g·L-1)、GFA(7.01 g·L-1)和 GFH (8.90 g·L-1)］0.80、1.00和1.20 mL，同法制成供試品溶液，進(jìn)樣，記錄色譜圖。結(jié)果測(cè)得，關(guān)白附藥材中GFI、GFA和GFH的平均加樣回收率分別為97.29%、101.46%和102.33%，RSD(n= 9)分別為3.29%、1.40%和2.42%。

2.5 樣品測(cè)定 稱取不同批次的關(guān)白附藥材樣品適量，同法制得供試品溶液，同時(shí)取“2.2.1”項(xiàng)下各對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣，記錄色譜圖，平行操作3次。取平均值，按外標(biāo)法計(jì)算樣品平均含量，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 樣品含量測(cè)定結(jié)果(mg·g-1，±s，n=3)Table1 Results of the content determination for samples

表1 樣品含量測(cè)定結(jié)果(mg·g-1，±s，n=3)Table1 Results of the content determination for samples

樣品批號(hào)GFI GFA GFH 0701 5.13±0.09 8.20±0.08 9.43±0.12 0702 5.05±0.04 7.10±0.08 8.53±0.10 0703 5.11±0.04 7.95±0.05 8.04±0.12 0704 5.59±0.04 8.65±0.02 10.08±0.18 0705 4.75±0.10 7.94±0.18 8.93±0.24 0801 5.25±0.06 5.76±0.11 6.27±0.09 0802 5.36±0.02 5.42±0.06 6.36±0.03 0803 5.96±0.11 5.94±0.05 5.94±0.03 0804 5.37±0.10 5.56±0.03 6.66±0.12 ___0805_______4.29±0.07___6.33±0.1___________________ 65.81±0.08

3 討論

本文采用超聲方法［9］，提取關(guān)白附中的主要成分二萜生物堿，發(fā)現(xiàn)其2年生與3年生藥材中GFI、GFA、GFH含量存在明顯差異，其中批號(hào)為0803的樣品中GFI含量最高，批號(hào)為0704的樣品中GFA和GFH含量最高。即總體來(lái)說(shuō)，3年生藥材中，GFA和GFH含量明顯高于2年生藥材，總堿含量也較高，這揭示了民間多采用3年生藥材的塊根入藥的原因。

目前文獻(xiàn)報(bào)道的關(guān)白附質(zhì)量控制方法大多采用指紋圖譜考查及GFA的HPLC法含量測(cè)定［10］，而尚未見(jiàn)同時(shí)測(cè)定活性成分GFA與強(qiáng)毒性成分GFH含量的報(bào)道。眾所周知，中藥起效的物質(zhì)基礎(chǔ)極其復(fù)雜，對(duì)單一活性成分的測(cè)定不能說(shuō)明藥材的效用本質(zhì)。本文通過(guò)對(duì)關(guān)白附中3種二萜生物堿的含量測(cè)定，發(fā)現(xiàn)同批次藥材中GFH含量大多高于GFA含量。因此，可對(duì)藥材進(jìn)行適當(dāng)?shù)呐谥苹蛴行У奶崛≈苽洌瑴p少其中毒性成分的含量，從而達(dá)到控制藥材質(zhì)量和安全用藥的目的。

本文所建立的同時(shí)測(cè)定3種生物堿——GFI、GFA和GFH的HPLC法，線性范圍寬，重復(fù)性好，可用于關(guān)白附藥材的質(zhì)量控制。

［1］ 吳貽谷，宋立人.中華本草［M］.上海:上海科學(xué)技術(shù)出版社，1998:499.

［2］ 后德輝，李玲，王秋娟，等.關(guān)附甲素對(duì)實(shí)驗(yàn)性心率失常的作用［J］.中國(guó)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，1981，17(2):68-74.

［3］ 董月麗，陳維洲.關(guān)附甲素對(duì)實(shí)驗(yàn)性心率失常和心肌收縮性的影響［J］.藥學(xué)學(xué)報(bào)，1995，30(8):577-582.

［4］ 薛姣，楊春華，劉靜涵，等.烏頭屬植物二帖類生物堿研究進(jìn)展［J］.海峽藥學(xué)，2009，21(2):1-10.

［5］ Huang Q，Wang G J，Sun JG，etal.Simultaneous determination of GFA and its activemetabolites in human plasma by liquid chromatography electrospray ionization mass spectrometry and its application to pharmacokinetic studies［J］.J Pharm Biomed Anal，2008，46(4): 728-736.

［6］ 王如斌，彭司勛，華維一.關(guān)附甲素的結(jié)構(gòu)修飾［J］.中國(guó)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，1992，23(5):257-259.

［7］ 劉靜涵，陳翔飛.關(guān)附素的結(jié)構(gòu)鑒定［J］.中國(guó)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，1985，16(3):58-60.

［8］ Dzhakhangirov FN，Bessonova IA.Alkaloids of Aconitum coreanum.X.Curare-like-structure relationship［J］.Chem Nat Comp，2002，38(1):74-77.

［9］ 王嚇長(zhǎng)，王強(qiáng)，劉靜涵.關(guān)白附的HPLC指紋圖譜［J］.中國(guó)天然藥物，2005，3(5):294-297.

［10］馮鋒，黃劍，劉靜涵.RP-HPLC法測(cè)定不同采收期黃花烏頭中關(guān)附甲素的含量［J］.中草藥，1999，30(7): 495-496.