李 瑩，李曉倩，王 興，辛 秀，張衛(wèi)國(guó)，王敏智（西南交通大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，成都市 610031）

天麻是蘭科植物天麻Gastrodia elata BL.的干燥塊莖，性甘、味平，歸肝經(jīng)，為治療肝陽(yáng)上亢、肝風(fēng)內(nèi)動(dòng)的要藥。天麻中含有天麻素、異天麻素、香莢蘭醇、香莢蘭醛、天麻多糖等成分[1]。本研究通過(guò)測(cè)定天麻與鉤藤配伍前后效應(yīng)成分天麻素（Gastrodin）在SHR大鼠肝臟、腎臟的分布，討論藥對(duì)配伍作用對(duì)天麻素在大鼠體內(nèi)分布過(guò)程的影響，初步探討天麻的歸經(jīng)理論和藥對(duì)配伍在歸經(jīng)中的意義。

1 儀器與材料

1.1 儀器

LC-20AT型高效液相色譜儀（日本島津儀器有限公司）；TU-1901型雙光束紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京普析通用儀器責(zé)任有限公司）；MTN-2800W型氮吹濃縮裝置（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）。

1.2 試藥

天麻、鉤藤購(gòu)自四川新荷花飲片公司，經(jīng)西南交通大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院宋良科副教授鑒定為真品；天麻素對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110807-200205）；間苯三酚（北京化學(xué)試劑公司，批號(hào)：040401）；甲醇、乙腈（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，色譜純）；其余試劑為分析純。

1.3 動(dòng)物

14周齡SHR大鼠65只，♂，體重（270±20）g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司（動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（滬）2008-0005）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Phenomenence Luna C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-1%磷酸（3∶97）；流速：1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：220 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取減壓干燥后的天麻素對(duì)照品適量，加甲醇溶解并稀釋成濃度為0.2 g·mL-1的天麻素對(duì)照品貯備溶液，備用。

2.2.2 內(nèi)標(biāo)溶液的制備 精密稱取減壓干燥后的內(nèi)標(biāo)間苯三酚適量，加甲醇溶解并稀釋成濃度為0.4 g·mL-1的內(nèi)標(biāo)溶液，備用。

2.3 分組與給藥

將65只SHR大鼠按體重隨機(jī)分為3組，即對(duì)照（等容生理鹽水）、天麻（0.95 g·kg-1）、天麻鉤藤（2.2 g·kg-1）組。其中對(duì)照組5只，天麻組和天麻鉤藤組分別按時(shí)間點(diǎn)細(xì)分為6個(gè)時(shí)間組，即15、30、60、120、180、240 min組，每組5只。制備0.1 g·mL-1的天麻混懸液、0.2 g·mL-1（天麻∶鉤藤＝3∶4）的共煎液。按照陳奇主編的《中藥藥理學(xué)方法》中的給藥量ig給藥。大鼠日給藥劑量＝人日給藥劑量×6.17×校正系數(shù)。其中，校正系數(shù)為大鼠實(shí)際體重與大鼠標(biāo)準(zhǔn)體重的比值。

2.4 樣品預(yù)處理

稱取大鼠肝臟與腎臟組織，置于勻漿器中，加入2.5倍生理鹽水，勻漿，3 000 r·min-1離心10 min，取上清液。精密吸取250 μL勻漿液，加8倍量甲醇和50 μL內(nèi)標(biāo)間苯三酚，渦旋混勻30 s，3 000 r·min-1離心5 min，取上清液，60 ℃水浴下氮吹干，100 μL 雙蒸水復(fù)溶，靜置 12 h，渦旋，10 000 r·min-1離心 10 min，取上清液，即得[2，3]。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

在8支塑料離心試管中，分別精密加入250 μL肝臟組織空白勻漿，再各加入50 μL內(nèi)標(biāo)溶液，將標(biāo)準(zhǔn)工作液配制成天麻素系列濃度分別為 200、50、20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.312 5 μg·mL-1的樣品。按“2.4”項(xiàng)下方法預(yù)處理樣品，分別吸取10 μL進(jìn)樣。以樣品濃度（X）為橫坐標(biāo)，樣品峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積之比（Y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得天麻素在肝臟中的回歸方程為Y＝0.008 2X－0.000 7（r＝0.999 5）；天麻素在腎臟中的回歸方程為Y＝0.010 9X－0.001 6（r＝0.999 9）。結(jié)果表明，天麻素的檢測(cè)濃度在0.312 5～200 μg·mL-1范圍內(nèi)同其峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積之比線性關(guān)系良好。

2.6 精密度與回收率試驗(yàn)

精密吸取250 μL大鼠肝臟、腎臟空白組織勻漿置于塑料離心管中，分別加入天麻素對(duì)照品貯備液適量，制成低、中、高濃度的樣品液，肝臟為0.625、5、50 μg·mL-1，腎臟為0.625、5、40 μg·mL-1，按“2.4”項(xiàng)下方法預(yù)處理樣品，并按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算得濃度A。上述處理得到的樣品分別在24 h內(nèi)每隔6 h測(cè)定1次，求算日內(nèi)精密度；并在連續(xù)4 d內(nèi)每天測(cè)定1次，求算日間精密度。精密度試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1、表2。

精密吸取250 μL流動(dòng)相，加入天麻素對(duì)照品貯備液適量，配制上述低、中、高濃度樣品液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算得濃度B。濃度B與加入量真實(shí)值之比為方法回收率；濃度A與濃度B之比為提取回收率?；厥章试囼?yàn)結(jié)果見(jiàn)表1、表2。

表1 肝臟樣品的回收率和精密度試驗(yàn)結(jié)果Tab 1 Precision and recovery of liver tissue

表2 腎臟樣品的回收率和精密度試驗(yàn)結(jié)果Tab 2 Precision and recovery of kidney tissue

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密配制天麻素低、中、高濃度的肝勻漿（0.625、5、50 μg·mL-1）和腎勻漿（0.625、5、40 μg·mL-1）樣品，置于－20 ℃冰箱30 d后，按“2.4”項(xiàng)下方法預(yù)處理，測(cè)得天麻素含量的RSD均＜5.7%；配制同樣樣品，置于－20℃冰箱保存24 h后室溫解凍1 h，取出少量測(cè)定天麻素含量，其余繼續(xù)－20℃冰箱保存24 h，反復(fù)凍融3次，測(cè)得天麻素含量的RSD均＜10%?？梢?jiàn)，天麻素在肝、腎組織樣品中有良好穩(wěn)定性。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一份組織勻漿樣品重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定天麻素含量，得RSD＝1.4%，表明該方法有良好重復(fù)性。

2.9 組織分布實(shí)驗(yàn)

將分組的SHR大鼠分別在末次給藥的15、30、60、120、180、240 min，經(jīng)股動(dòng)脈及斷頭放血后，取出肝臟和腎臟制備勻漿液樣品并進(jìn)樣測(cè)定。各時(shí)間點(diǎn)組織中的天麻素含量見(jiàn)表3。

表3 各時(shí)間點(diǎn)組織中的天麻素含量（mg·g-1）Tab 3 Content of gastrodin in tissue for each time point（mg·g-1）

配伍前后肝臟、腎臟的2組數(shù)據(jù)分別用SPSS17.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)，討論是否有顯著性差異。配伍前后顯著性差異分析見(jiàn)表4。

表4 配伍前后顯著性差異分析Tab 4 Analysis of significant difference before and after compatibility of G.elata and Uncariae Ramulus Cum Uncis Uncariae

由表4可見(jiàn)，肝臟、腎臟中配伍前后2組數(shù)據(jù)用t檢驗(yàn)分析，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討論

研究結(jié)果表明，SHR大鼠ig天麻混懸液后，效應(yīng)成分天麻素在腎臟內(nèi)的最高血藥濃度（Cmax）高于肝臟。這與文獻(xiàn)[4]報(bào)道中使用放射自顯影方法所測(cè)定的結(jié)果基本一致。但是在給予天麻鉤藤水煎液后，效應(yīng)成分的組織分布情況卻出現(xiàn)了逆轉(zhuǎn)。這說(shuō)明并不能單純地以使用單味藥物時(shí)某些時(shí)間點(diǎn)中藥有效成分在體內(nèi)的選擇性分布來(lái)論證中藥的歸經(jīng)理論，還需從其與藥物的配伍使用等方面來(lái)綜合考慮。

根據(jù)數(shù)據(jù)顯示，天麻與鉤藤配伍后，天麻素在肝臟中Cmax增大，分布速率加快，消除速率加快；在腎臟中Cmax減小，消除速率減慢。綜上結(jié)果，推論鉤藤對(duì)天麻歸肝經(jīng)可能有協(xié)同增強(qiáng)作用。這與天麻鉤藤飲方解中的天麻、鉤藤共為君藥，配伍使用以達(dá)平肝熄風(fēng)之療效[5]相一致。

研究數(shù)據(jù)顯示，SHR大鼠ig天麻混懸液后，天麻素在肝臟的分布出現(xiàn)雙峰，而在腎臟中并未出現(xiàn)此情況。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，某些采用正常大鼠血漿為對(duì)象進(jìn)行的天麻素藥動(dòng)學(xué)研究中血漿濃度也出現(xiàn)了二次達(dá)峰的現(xiàn)象[4]，據(jù)此推斷天麻素在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)過(guò)程可能存在“肝腸循環(huán)”的情況，本研究中肝臟二次達(dá)峰的現(xiàn)象可能與之有關(guān)。但是在已有的文獻(xiàn)報(bào)道中，天麻素是否在大鼠體內(nèi)存在肝腸循環(huán)還存在爭(zhēng)議，故此具體的原因還需進(jìn)一步進(jìn)行論證。

數(shù)據(jù)顯示，SHR大鼠ig天麻混懸液后，肝臟在180 min出現(xiàn)二次達(dá)峰，而天麻與鉤藤配伍后雙峰現(xiàn)象消失。這是否說(shuō)明天麻與鉤藤的配伍使用影響了天麻素的肝腸循環(huán)還有待于進(jìn)一步的研究論證。

由本研究可知，天麻與鉤藤的配伍使用對(duì)天麻中的效應(yīng)成分天麻素在SHR大鼠體內(nèi)的分布有較大影響，明顯改變了天麻素的藥動(dòng)學(xué)過(guò)程。但是，產(chǎn)生這種影響的原因是否由于天麻、鉤藤的配伍對(duì)天麻歸肝經(jīng)有協(xié)同加強(qiáng)的作用，還有待于通過(guò)其他大量的研究證實(shí)。

[1] 康延國(guó).中藥鑒定學(xué)[M].北京：中國(guó)中醫(yī)藥出版社，2005：237.

[2] 王 興，胡瑞娟，黃 熙，等.RP-HPLC測(cè)定大鼠服用大川芎丸提取物后血漿中的天麻素[J].華西藥學(xué)雜志，2003，18（5）：341.

[3] 程 剛，郝秀華，劉國(guó)良，等.天麻素在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)研究[J].中國(guó)藥學(xué)雜志，2003，38（2）：128.

[4] 陸光偉，鄒元杰，莫啟忠.3H-天麻素在大鼠體內(nèi)的吸收分布、代謝和排泄[J].藥學(xué)學(xué)報(bào)，1985，20（3）：167.

[5] 段富津.方劑學(xué)[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2005：225.