曾漢元, 黃小波, 許方美

(懷化學(xué)院生命科學(xué)系,湖南懷化 418008)

中藥材虎杖為蓼科多年生草本植物虎杖(Reynoutria japonica)的莖和根,被歷版《中華人民共和國(guó)藥典》收載.性味苦寒,具有祛風(fēng)利濕,祛痰止咳,清熱解毒,活血化瘀等功效.研究表明,虎杖中所含的白藜蘆醇是其有效成分之一[1],具有強(qiáng)心擴(kuò)血管、抑制血小板聚集、降血脂、鎮(zhèn)咳平喘、抗菌、抗病毒、抗腫瘤等多種作用[2],是治療顱內(nèi)出血、糖尿病、組織癌變和抑制腫瘤發(fā)生最有前途的藥物之一[3-5].此外,虎杖嫩莖可以食用,可作為綠色食品來(lái)開發(fā).

盾葉薯蕷(Dioscorea zingiberensi)為薯蕷科草質(zhì)纏繞藤本植物,是一種常用的中草藥,根莖可治療各種急性化膿性感染、軟組織損傷,并有抗腫痛和降血糖的作用,對(duì)治療冠心病和腦血管病有特效[6].其根莖含薯蕷皂苷元,是合成甾體激素類藥物的主要原料.近年來(lái)的研究表明,對(duì)薯蕷皂苷元甾體環(huán)的每一次化學(xué)修飾,都能產(chǎn)生一種療效奇特的甾體藥物.目前,以薯蕷皂素為原料已合成了300多種激素藥物,展示了薯蕷皂素廣闊的醫(yī)藥前景[6].

在虎杖和盾葉薯蕷的組織培養(yǎng)研究方面已有一些報(bào)道[7-9],但他們報(bào)道的培養(yǎng)基配方中應(yīng)用的細(xì)胞分裂素為激動(dòng)素 (KT).考慮到KT的價(jià)格高且耐熱性較差,因此,我們改用價(jià)廉且相對(duì)耐熱的6-BA對(duì)這兩種藥材進(jìn)行了組培研究.

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)材料虎杖采自懷化市賀家田鄉(xiāng),種植于懷化學(xué)院生物園內(nèi);盾葉薯蕷采自中方縣盾葉薯蕷良種繁育基地,室內(nèi)盆栽.

1.2 外植體最佳消毒時(shí)間的確定

取虎杖和盾葉薯蕷的嫩芽,流水沖洗干凈;用0.1%升汞溶液作消毒劑,各設(shè)計(jì)三組不同的消毒時(shí)間,分別消毒5 min、10 min和15 min,用無(wú)菌水沖洗4～5次,在超凈工作臺(tái)內(nèi)接種在MS基本培養(yǎng)基中,然后放在人工氣候箱中進(jìn)行培養(yǎng),一周后觀察,根據(jù)滅菌結(jié)果確定適宜滅菌時(shí)間.每種滅菌時(shí)間處理的材料接種6瓶.

1.3 培養(yǎng)基的設(shè)計(jì)

以MS為基本培養(yǎng)基,附加不同濃度的2,4-D和6-BA(單位：mg/L,下同),各培養(yǎng)基均添加30 g/L蔗糖、8 g/L瓊脂,pH5.8.培養(yǎng)基中激素配比見表2～4,外植體全部采用前面篩選出的適宜滅菌時(shí)間進(jìn)行滅菌.每種配方接種6瓶.

1.4 培養(yǎng)

接種后,放在人工氣候箱中進(jìn)行培養(yǎng),培養(yǎng)條件為：溫度20～25℃,濕度70%～80%,誘導(dǎo)愈傷組織時(shí)不開燈光;對(duì)愈傷組織進(jìn)行分化培養(yǎng)時(shí),光照強(qiáng)度為20μmol/m2.s,光照時(shí)間為12 h/d.

2 結(jié)果

2.1 不同滅菌時(shí)間處理的結(jié)果

采用0.1%升汞的三種不同滅菌時(shí)間分別對(duì)虎杖和盾葉薯蕷進(jìn)行滅菌處理的實(shí)驗(yàn)結(jié)果 (表1).由表1可知,虎杖和盾葉薯蕷嫩芽的適宜滅菌時(shí)間為10 min.

表1 不同滅菌時(shí)間處理的結(jié)果

2.2 不同濃度激素配比對(duì)虎杖愈傷組織的誘導(dǎo)結(jié)果

采用不同濃度的生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素配比對(duì)虎杖愈傷組織的誘導(dǎo)結(jié)果,如表2.

表2 不同濃度激素配比對(duì)虎杖愈傷組織的誘導(dǎo)結(jié)果

由表2可知,在以上6組配方中,以第2組2,4-D 0.2+6-BA 1.0效果最好.

2.3 不同濃度激素配比對(duì)盾葉薯蕷愈傷組織的誘導(dǎo)結(jié)果

采用不同濃度的生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素配比對(duì)盾葉薯蕷愈傷組織的誘導(dǎo)結(jié)果,如表3.

表3 不同濃度激素配比對(duì)盾葉薯蕷愈傷組織的誘導(dǎo)結(jié)果

由表3可知,在以上6組配方中,以第6組2,4-D 0.5+6-BA 2.0效果最好.

2.4 盾葉薯蕷愈傷組織的分化培養(yǎng)結(jié)果

采用不同濃度的生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素配比對(duì)盾葉薯蕷愈傷組織進(jìn)行分化培養(yǎng)的結(jié)果,如表4.

表4 盾葉薯蕷愈傷組織的分化培養(yǎng)結(jié)果

由表4可知,培養(yǎng)出的愈傷組織轉(zhuǎn)接到MS+2,4-D 0.5+6-BA 0.1或者M(jìn)S+2,4-D 0.2+6-BA 0.1的培養(yǎng)基中都能分化出芽,但是后者長(zhǎng)勢(shì)弱.考慮到細(xì)弱的苗在移栽時(shí)難以成活,因此,分化培養(yǎng)時(shí)以采用前者為宜.

2.5 盾葉薯蕷的生根培養(yǎng)

當(dāng)盾葉薯蕷的叢生芽長(zhǎng)到5～7 cm時(shí),將其分割成單株,然后轉(zhuǎn)入培養(yǎng)基MS+2,4-D 0.5中培養(yǎng),20 d后,生根率達(dá)80%以上.

2.6 移栽

當(dāng)根長(zhǎng)到5 cm以上且根數(shù)達(dá)到5條以上時(shí)進(jìn)行煉苗和移栽.先將培養(yǎng)瓶瓶口半開5 d,然后將瓶口全部打開,6 d后取出組培苗,用清水洗凈根系附著的培養(yǎng)基,移栽到經(jīng)高壓滅菌的腐殖土中,用無(wú)菌水一次澆透,放在人工氣候箱中培養(yǎng),溫度為22～25℃,濕度為70%～85%.6 d后,幼苗葉片顏色呈綠色;15 d后進(jìn)行換盆移栽,移栽成活率為70%.

3 討論

(1)在對(duì)一種新的材料進(jìn)行組織培養(yǎng)時(shí),首先應(yīng)該研究適宜的滅菌時(shí)間.滅菌時(shí)間恰到好處,才能達(dá)到“既殺滅微生物又保存盡可能多的活組織細(xì)胞”的目的.滅菌是否合適的判斷方法是：如果接種材料大部分發(fā)生污染,說(shuō)明外植體的消毒時(shí)間短或者消毒劑濃度偏低;若接種材料雖然沒(méi)有污染,但材料已發(fā)黃,組織變軟,表明消毒時(shí)間過(guò)長(zhǎng),組織被破壞死亡;接種材料若沒(méi)有出現(xiàn)污染,且生長(zhǎng)正常,即可以認(rèn)為消毒時(shí)間合適.

圖1 虎杖愈傷組織

圖2 虎杖愈傷組織直接分化出莖和葉

圖3 盾葉薯蕷的愈傷組織

圖4 盾葉薯蕷的叢生芽

(2)虎杖愈傷組織在弱光照射下,在原培養(yǎng)基中再經(jīng)過(guò)8周培養(yǎng)后直接分化出了莖和葉.可能原因是：在弱光照射下,部分愈傷組織細(xì)胞發(fā)育出葉綠體,含有葉綠體的細(xì)胞合成了一些生長(zhǎng)素類物質(zhì),從而促進(jìn)了莖和葉的形成.

(3)Skoog和Miller等提出：在組織培養(yǎng)中,生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素的比例決定根和芽的分化：脫分化時(shí)生長(zhǎng)素低,細(xì)胞分裂素高;再分化時(shí)生長(zhǎng)素高,細(xì)胞分裂素低.這一理論對(duì)于指導(dǎo)培養(yǎng)基配方的設(shè)計(jì)、減少實(shí)驗(yàn)工作量具有一定的指導(dǎo)意義.

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