陳麗麗趙 利劉 華鄒勝員

（1.江西科技師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，江西 南昌 330013；2.江西省水產(chǎn)技術(shù)推廣站，江西 南昌 330046）

有機(jī)酸提取鮰魚(yú)皮膠原蛋白的工藝研究

陳麗麗1趙 利1劉 華1鄒勝員2

（1.江西科技師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，江西 南昌 330013；2.江西省水產(chǎn)技術(shù)推廣站，江西 南昌 330046）

采用酸法對(duì)鮰魚(yú)皮中膠原蛋白進(jìn)行提取，對(duì)提取膠原蛋白過(guò)程中酸的種類(lèi)、酸的濃度、固液比、提取時(shí)間和提取溫度對(duì)膠原蛋白提取率的影響進(jìn)行研究。結(jié)果表明，酸法提取鮰魚(yú)皮中膠原蛋白的最佳工藝為：0.5mol/L的醋酸作為浸提劑，采用1∶50（m∶V）的固液比，在15℃下提取72h，提取率最高為62.05%。同時(shí)，測(cè)定了鮰魚(yú)皮中膠原蛋白的氨基酸組成。

鮰魚(yú)皮；膠原蛋白；有機(jī)酸；提取

膠原蛋白是一種生物性高分子物質(zhì)，具有良好的生物相容性、可生物降解性以及促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)的特性［1－3］，在動(dòng)物細(xì)胞中扮演結(jié)締組織的角色，對(duì)人體細(xì)胞、組織、器官具有增強(qiáng)、替代、修復(fù)、再生的作用，是需求量最大的一種生物醫(yī)藥材料，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、化妝品、食品工業(yè)、生物合成等領(lǐng)域。

目前生產(chǎn)膠原蛋白制品的原料主要來(lái)源是豬、牛等陸生哺乳動(dòng)物的皮、骨和肌腱，但因近年來(lái)隨著全球生態(tài)環(huán)境惡化導(dǎo)致瘋牛病、口蹄疫等許多流行病的發(fā)生，使得從陸生動(dòng)物皮、骨中提取膠原蛋白的危險(xiǎn)性增大［4］。因此，從水生動(dòng)物魚(yú)體廢棄物中提取膠原蛋白已成為當(dāng)前國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者研發(fā)的一個(gè)熱門(mén)課題。隨著淡水魚(yú)產(chǎn)品的加工能力、產(chǎn)量和產(chǎn)值的逐年增長(zhǎng)，淡水魚(yú)加工廢棄物的數(shù)量將越來(lái)越多［5］，如果不進(jìn)行有效的處理，會(huì)造成資源的浪費(fèi)和環(huán)境的污染，如何將其變廢為寶，是一個(gè)亟待解決的問(wèn)題。

本試驗(yàn)以鮰魚(yú)皮為研究對(duì)象，采用有機(jī)酸法對(duì)鮰魚(yú)皮中膠原蛋白的提取工藝進(jìn)行了初步探討。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮰魚(yú)皮：江西鑫海水產(chǎn)食品有限公司；

所有的化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 主要儀器及設(shè)備

磁力攪拌器：JJ－1A，常州市華普達(dá)教學(xué)儀器有限公司；

數(shù)顯恒溫水浴鍋：HH－4，江西省金壇市榮華儀器制造有限公司；

冷凍離心機(jī)：Evolution RC，上海中科伍佰豪生物工程有限公司；

紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：UV－1100，上海美譜達(dá)儀器有限公司；

電腦恒溫層析柜：CXG－1，上海瀘西分析儀器廠(chǎng)有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：N－1100，上海亞榮生化儀器廠(chǎng)；

冷凍干燥機(jī)：Labconco 2.5L，北京眾益中和生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 鮰魚(yú)皮的預(yù)處理 取出冷凍的鮰魚(yú)皮，流水化凍后，仔細(xì)將皮下肉、脂肪及結(jié)締組織剔除，分切成碎片，用10%的異丙醇（1∶4）于4℃萃取24h，去除脂肪類(lèi)物質(zhì)，用去離子水清洗。然后在脫脂后的魚(yú)皮中分別加入濃度為5%的氯化鈉溶液（1∶10），于4℃連續(xù)攪拌24h，過(guò)濾，用去離子水（1∶10）水洗樣品并過(guò)濾，重復(fù)3次，去除魚(yú)皮中的非膠原蛋白。

1.3.2 鮰魚(yú)皮中膠原蛋白的提取 魚(yú)皮膠原蛋白的提取過(guò)程均在10℃以下進(jìn)行。向預(yù)處理好的鮰魚(yú)皮中加入一定量的醋酸、乳酸和檸檬酸試劑，連續(xù)攪拌一定時(shí)間，然后用高速冷凍離心機(jī)離心（10 000r/min，30min，10℃），得上清液即魚(yú)皮膠原蛋白的提取液，冷凍干燥得到膠原蛋白。

1.3.3 膠原蛋白提取率的測(cè)定 膠原蛋白含有大量的甘氨酸、脯氨酸、羥脯氨酸、羥賴(lài)氨酸等，其中羥脯氨酸和羥賴(lài)氨酸在其他蛋白質(zhì)中很少見(jiàn)［6］，為膠原蛋白所特有。通過(guò)測(cè)定羥脯氨酸的含量，然后乘以相應(yīng)的系數(shù)就可以得到膠原蛋白的含量［7］。

量取1mL離心后的粗提液和6mol/L鹽酸溶液10mL于水解管中，抽真空，用酒精噴燈封管，于110℃的烘箱中水解反應(yīng)24h后，冷卻取出。打開(kāi)水解管的封口，將水解液移入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)管中，蒸干鹽酸，用去離子水稀釋?zhuān)ㄈ艿?00mL，搖勻，參照文獻(xiàn)［8］測(cè)定羥脯氨酸的含量。膠原蛋白的提取率按式（1）計(jì)算：

1.3.4 醋酸提取膠原蛋白的正交試驗(yàn) 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取醋酸濃度、浸提時(shí)間、浸提溫度和固液比為試驗(yàn)因子，以膠原蛋白的提取率為指標(biāo)，采用L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，進(jìn)行酸法提取工藝研究。正交試驗(yàn)方案見(jiàn)表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平Table 1 Factors and levels of the orthogonal experiment

1.3.5 氨基酸組成分析 氨基酸組成分析采用高效液相色譜法－AccQ.Tag柱前衍生法。凍干的膠原蛋白中加入6mol/L HCl后真空封管，置110℃烘箱水解24h。水解液加入AccG.Tag衍生劑進(jìn)行衍生反應(yīng)，然后將樣品上柱分析。

1.3.6 膠原蛋白純化方法 將鮰魚(yú)皮膠原蛋白的提取液離心，得到上清液，加氯化鈉至2.5mol/L進(jìn)行攪拌鹽析，然后冷凍離心（10 000r/min，20min，4℃），沉淀物以0.5mol/L的醋酸溶液復(fù)溶，復(fù)溶得到的膠原蛋白溶液對(duì)0.1mol/L醋酸溶液透析24h（1∶15，V/V，每4h換透析外液1次）后，對(duì)去離子水繼續(xù)透析48h（1∶15，V/V，每4h換透析外液1次），冷凍干燥，得到奶白色膠原蛋白。

2 結(jié)果與分析

2.1 羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制

測(cè)定不同濃度的羥脯氨酸的A560值，繪制羥脯氨酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 羥脯氨酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Figure 1 Standard curve of hydroxyproline

由圖1可知，羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)樣品的回歸方程為Y＝0.058 8X＋0.008 2（R2＝0.999 3）。

2.2 有機(jī)酸提取鮰魚(yú)皮膠原蛋白的單因素工藝

2.2.1 酸的種類(lèi)對(duì)提取率的影響 分別以0.5mol/L的檸檬酸、乙酸和乳酸為浸提劑，固液比為1∶40（m∶V），在4℃浸提24h，考察不同酸對(duì)鮰魚(yú)皮中膠原蛋白提取的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 不同酸對(duì)鮰魚(yú)皮中膠原蛋白提取的影響Figure 2 Effect of different acids on the extraction of collagen

由圖2所示，3種酸中，醋酸對(duì)鮰魚(yú)皮中膠原蛋白的浸提效果最好，提取率達(dá)到38.44%。因而，選用醋酸對(duì)其浸提鮰魚(yú)皮中膠原蛋白提取工藝進(jìn)行下一步的探討。

2.2.2 醋酸濃度對(duì)鮰魚(yú)皮中膠原蛋白提取的影響 分別以0.1，0.2，0.3，0.5mol/L醋酸為浸提劑，固液比為1∶40（m∶V），于4℃下浸提24h，考察醋酸濃度對(duì)鮰魚(yú)皮中膠原蛋白提取的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。

由圖3可知，隨著醋酸濃度的增加，膠原蛋白的提取率也增加，濃度超過(guò)0.5mol/L后，提取率增加很慢。醋酸濃度超過(guò)0.5mol/L時(shí)，膠原蛋白開(kāi)始變性，導(dǎo)致提取率下降；醋酸濃度太低，膠原蛋白不能充分提取出來(lái)。因此，以0.5mol/L的醋酸為浸提劑較好。

圖3 醋酸濃度對(duì)鮰魚(yú)皮膠原蛋白提取的影響Figure 3 Effect of acetic acids concentration on the extraction of collagen

2.2.3 浸提時(shí)間對(duì)鮰魚(yú)皮中膠原蛋白提取的影響 以0.5mol/L的乙酸為浸提劑，固液比為1∶40，于4℃下浸提24，48，72，96h，考察不同浸提時(shí)間對(duì)鮰魚(yú)皮中膠原蛋白的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 時(shí)間對(duì)鮰魚(yú)皮中膠原蛋白提取的影響Figure 4 Effect of time on the extraction of collagen

由圖4可知，在72h之內(nèi)隨時(shí)間的延長(zhǎng)，膠原蛋白的提取率增加較快，但是超過(guò)72h，提取率增加不顯著，為了提高效率，節(jié)約時(shí)間，選擇72h為最佳浸提時(shí)間。

2.2.4 溫度對(duì)鮰魚(yú)皮中膠原蛋白提取的影響 以0.5mol/L的醋酸為浸提劑，固液比為1∶40（m∶V），于不同的溫度下浸提72h，考察不同溫度對(duì)鮰魚(yú)皮中膠原蛋白提取的影響，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 溫度對(duì)鮰魚(yú)皮中膠原蛋白提取的影響Figure 5 Effect of temperatures on the extracton of collagen

由圖5可知，在5～15℃之內(nèi)，膠原蛋白的提取率變化很緩慢，溫度高于15℃時(shí)，膠原蛋白的提取率明顯降低。如果溫度太低，在提取的過(guò)程中提取液很粘稠，分離較困難。因此，選擇15℃為最佳提取溫度。

2.2.5 固液比對(duì)鮰魚(yú)皮中膠原蛋白提取的影響 以0.5mol/L的醋酸為浸提劑，在15℃下浸提72h，采用不同的固液比，考察固液比對(duì)鮰魚(yú)皮中膠原蛋白提取的影響，結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6 料液比對(duì)鮰魚(yú)皮中膠原蛋白提取率的影響Figure 6 Effect of solid－liquid ratio on the extraction of collagen

由圖6可知，固液比越小，鮰魚(yú)皮不能完全浸泡其中，提取率低，固液比高，對(duì)提取率的影響很小，反而造成膠原蛋白分離純化困難，因此，提取鮰魚(yú)皮中膠原蛋白的最佳固液比為1∶50（m∶V）。

2.3 醋酸提取鮰魚(yú)皮中膠原蛋白的工藝條件的優(yōu)化

選取4因子3水平正交組合試驗(yàn)L9（34），按照正交表確定的9個(gè)條件組合，對(duì)單因素試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行正交設(shè)計(jì)優(yōu)化。正交試驗(yàn)結(jié)果及方差分析分別見(jiàn)表2和表3。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果分析Table 2 Rusults and analysis of orthogonal experiment

由正交試驗(yàn)的極差分析和方差分析結(jié)果可知，用醋酸提取鮰魚(yú)皮中膠原蛋白，各因素對(duì)鮰魚(yú)皮中膠原蛋白提取率的影響程度依次為：酸濃度＞浸提時(shí)間＞溫度＞固液比。最后得出最佳酸提取條件為0.5mol/L的乙酸作為浸提劑，采用1∶50（m∶V）的固液比，在15℃提取72h。經(jīng)過(guò)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，最佳條件下，膠原蛋白的提取率達(dá)到62.05%。4個(gè)因素中，酸濃度、浸提時(shí)間和溫度對(duì)膠原蛋白的提取率影響顯著。

表3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方差分析?Table 3 Variance analysis of orthogonal experiment

2.4 鮰魚(yú)皮中膠原蛋白的氨基酸組成分析

由表4可知，鮰魚(yú)皮的酸溶性膠原蛋白純化和未純化樣品的氨基酸組成差異很小，其中甘氨酸含量最多，分別為23.10% 和24.88%；必需氨基酸（賴(lài)氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、色氨酸和苯丙氨酸）分別占總氨基酸的15.30%和16.77%，半必需氨基酸（精氨酸、組氨酸）分別占總氨基酸的10.50%和11.98%。據(jù)文獻(xiàn)［9］記載鮟鱇魚(yú)皮酸溶性膠原蛋白的必需氨基酸和半必需氨基酸分別占總氨基酸的13.46% 和5.75%。由此可見(jiàn)，鮰魚(yú)皮的酸溶性膠原蛋白（ASC）是氨基酸的很好來(lái)源。

表4 鮰魚(yú)皮中膠原蛋白的氨基酸組成Table 4 Amino acid composition of collagen from the skin of amiurus nebulosus

通常來(lái)說(shuō)，膠原蛋白的半胱氨酸和色氨酸含量很低或沒(méi)有［10］。鮰魚(yú)皮ASC的色氨酸含量很低，僅為0.14%（未純化的為0.31%），而半胱氨酸含量小于0.01%。亞氨酸（脯氨酸和羥脯氨酸）是膠原蛋白的特征性氨基酸，羥脯氨酸是脯氨酸在轉(zhuǎn)譯后由脯氨酸羥基化作用產(chǎn)生的［11］。鮰魚(yú)皮的酸溶性膠原蛋白中亞氨酸含量為分別為21.82%和25.47%。與羅非魚(yú)皮中膠原蛋白的25.4%很接近［12］，但高于草魚(yú)皮中膠原蛋白的18.6%［13］。

3 結(jié)論

（1）本試驗(yàn)選擇出最佳酸提取鮰魚(yú)皮中膠原蛋白工藝條件，0.5mol/L的乙酸，固液比為1∶50（m∶V），15℃的條件下浸提72h，鮰魚(yú)皮中膠原蛋白的提取率為62.05%。

（2）鮰魚(yú)皮的酸溶性膠原蛋白純化和未純化樣品的氨基酸組成差異很小，其中甘氨酸含量最多，分別為23.10%和24.88%；必需氨基酸（賴(lài)氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、色氨酸和苯丙氨酸）分別占總氨基酸的15.30% 和16.77%，半必需氨基酸（精氨酸、組氨酸）分別占總氨基酸的10.50%和11.98%。

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Research on the extraction technology of collagen from amiurus nebulosus skin with organic acid

CHEN Li－li1ZHAO Li1LIU Hua1ZOU Sheng－yuan2

（1.School of Life Science，Jiangxi Normal University of Science and Technology，Nanchang，Jiangxi330013，China；2.Jiangxi Aquaculture Technology Spreading Center，Nanchang，Jiangxi330046，China）

The technology of extracted collagen from the skin of amiurus nebulosus was studied in the paper.The extraction technologies were studied，including the kind of acid，concentration of acid，immersion time and temperature.The optimal processing conditions were obtained by orthogonal experiments.The result showed skin of amiurus nebulosus was immersed in 0.5mol/L acetic acid（1∶50，m∶V）for 72hat 15 ℃，the ratio of the collagen extraction was 62.05%.Amino acid of collagen was determinated.

amiurus nebulosus skin；collagen protein；organic acid；extraction

10.3969 /j.issn.1003－5788.2010.05.034

農(nóng)業(yè)部948“引進(jìn)國(guó)際先進(jìn)農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)”（編號(hào)：2010－Z57）；江西省科技計(jì)劃成果重點(diǎn)推廣計(jì)劃項(xiàng)目（編號(hào)：2009CCA01100P19－1）

陳麗麗（1986－），女，江西科技師范學(xué)院在讀碩士研究生。E－mail：lilichen05＠163.com

趙利

2010－05－01