王慶忠,任科云

(濰坊學(xué)院,山東 濰坊 261061)

IGF-II在原核生物中的表達(dá)＊

王慶忠,任科云

(濰坊學(xué)院,山東 濰坊 261061)

胰島素生長(zhǎng)因子IGF-Ⅰ和 IGF-Ⅱ在機(jī)體的許多組織中都有表達(dá),具有促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和分裂等的多種生物學(xué)功能。在本研究中,我們采用RT-PCR法克隆和擴(kuò)增到了IGF-Ⅱ基因,通過(guò)雙酶切、膠回收純化、連接后得到了p ET21b-IGF-Ⅱ重組質(zhì)粒載體,然后將其轉(zhuǎn)化DH5α中,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后表達(dá)的重組蛋白經(jīng)純化,并用Western blot檢測(cè),顯示重組質(zhì)粒p ET21b-IGF-Ⅱ編碼一個(gè)約25kD的外源蛋白。

IGF-Ⅱ;RT-PCR;原核表達(dá)載體;表達(dá)

胰島素樣生長(zhǎng)因子(insulin-like grow th factors,IGFs)是一類既有細(xì)胞分化和增殖活性,又有胰島素樣作用的多肽,包括IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ兩種。IGF-Ⅱ也被稱為生長(zhǎng)調(diào)節(jié)素A(somatomedio A)。是Dechiara T M等發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)內(nèi)源性印跡基因表達(dá)產(chǎn)生的生長(zhǎng)因子[1]。IGF2為單鏈多肽,分子量7.5ku,有A、B、C、D四個(gè)區(qū)域[2-3]。IGFs在結(jié)構(gòu)和功能上與胰島素相似,具有促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂的生物學(xué)功能,對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)與分化起重要的調(diào)節(jié)作用,機(jī)體的許多組織器官都有IGFs的表達(dá)[4]。最近又發(fā)現(xiàn)IGF-Ⅱ能刺激神經(jīng)及肌肉再生,是目前生物、醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。由于天然IGF-Ⅱ的分離困難,阻礙了研究的深入。因此,我們利用基因工程方法克隆IGF-Ⅱ基因,構(gòu)建原核表達(dá)載體,并在原核細(xì)胞中表達(dá)IGF-Ⅱ因子,為其調(diào)控機(jī)制研究以及它的應(yīng)用打下基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

ICR小鼠購(gòu)自濰坊醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

菌株為DH5α和BL21(DE3)。質(zhì)粒為p GEM-T vector(Promega)和p ET21b vector(Novagen)主要化學(xué)試劑及耗材包括 TRlzol Reagent(Invitrogen)、Ribonuclease Inhibito r(aKaRa Biotech)、限制性內(nèi)切酶(TaKaRa Biotech)、LA Taq DNA polymerase(TaKaRa Biotech)、M-MLV(Invitrogen life technologies)、T4 DNA Ligase(Promega)、凝膠回收試劑盒和質(zhì)?；厥赵噭┖?天為時(shí)代)、低分子量蛋白M arker (上海生科院研制)等。

2 研究方法

2.1 引物設(shè)計(jì)與合成

以p rimer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物,并用verto r N TI 9.0進(jìn)行分析。引物序列如下:

Sense p rime:5’-GCGAA TTCGCCCGCTGTTCGGTT-3’

Anti-sense p rime:5’-CGGAA TTCGAGGA GGTCACAGA TTG-3’

正向引物和反向引物中同時(shí)引入了EcoR I酶切位點(diǎn)。引物由上海生工合成。克隆基因的測(cè)序由上海博亞(三博遠(yuǎn)志)完成。

2.2 組織總RNA的提取

(1)取小鼠心臟組織200mg,放到勻漿器中,加1m lTrizol試劑研磨。

(2)轉(zhuǎn)至DEPC水處理管,然后以每1m lTrizol加入0.2m l的比例加入氯仿,蓋緊離心管,用手劇烈震蕩離心管15秒,室溫放置5min。

(3)4℃下12000g離心5m in。

(4)取上層水相于一新的離心管,按每1m lTrizol加入0.5m l的比例加入異丙醇,室溫放置10min,4℃下12000g離心15min。

(5)棄去上清液,按每1m lTrizol加入1m l的比例加入75%乙醇(用DEPC水現(xiàn)配),渦旋混勻,4℃下7500g離心5min。

(6)小心棄去上清液,然后室溫或真空干燥5-10min,注意不要干燥過(guò)分,否則會(huì)降低RNA的溶解度。然后將RNA溶于20-40ulDEPC水中,必要時(shí)可55-60℃水溶10分鐘,70℃保存。

2.3 RT-PCR克隆IGF-Ⅱ基因

反轉(zhuǎn)錄酶是M-MLV,反應(yīng)體系如下:

總RNA 5.0μl(2.0μg)

Oligo(d T)18 1.0μl

M-MLV 5×buffer 8.0μl

dN TP(10mM) 2.0μl

M-MLV 2.0μl(200U/μl)

RNasin 1.0μl

DEPC水 1μl

混勻后,瞬間離心10秒。置42℃作用60min,然后置70℃10min以終止反應(yīng)。取上述模板DNA(反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物)1μl,加入Ep管中,PCR反應(yīng)體系如下:

dd H 2O 13.5μl

10×RNA PCR Buffer 2μl

4×dN TP混合物(2.5mM) 1μl

有義引物 1μl

反義引物 1μl

模板 1μl

TaqDNA聚合酶 0.5μl

混勻后,瞬時(shí)離心。PCR參數(shù)設(shè)定為:94℃預(yù)變性4 min;然后是94℃變性1 m in、55℃復(fù)發(fā)45sec、72℃延伸1 min,共30循環(huán);最后是72℃延伸10 min。

2.4 電泳回收DNA與連接到T載體

PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳后加以回收?；厥詹僮靼丛噭┖姓f(shuō)明書進(jìn)行。然后將回收的產(chǎn)物連接到 T載體,連接反應(yīng)按T-Vecto r使用說(shuō)明進(jìn)行,體系10μl,混勻15℃連接16個(gè)小時(shí)。

2.5 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化與篩選

常規(guī)方法轉(zhuǎn)化和進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。

2.6 測(cè)序

分別挑取6-8個(gè)陽(yáng)性菌落,接種到LB培養(yǎng)中培養(yǎng),然后提取質(zhì)粒,電泳檢測(cè)后,送公司測(cè)序。

2.7 構(gòu)建原核表達(dá)載體

分別取5μl測(cè)序結(jié)果中序列正確的質(zhì)粒和5μlp ET21b表達(dá)質(zhì)粒載體,分別加1μl內(nèi)切酶切緩沖液, EcoRⅠ酶1μl,無(wú)菌水補(bǔ)至總體積10μl,37℃保溫1.5h。然后,通過(guò)瓊脂糖產(chǎn)凝膠電泳檢測(cè)酶切結(jié)果,并回收酶切產(chǎn)物。連接體系同前,連接完畢后,轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)菌,并篩選陽(yáng)性菌落和進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定。

2.8 IPTG誘導(dǎo)表達(dá)與Western blo t檢測(cè)

先將含IGF-II基因的表達(dá)菌株在LB培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)過(guò)夜。

100m lTM培養(yǎng)基加入100μl50m g/m LAM P,使終濃度達(dá)50μg/m l;然后按1/50-1/100比例加入過(guò)夜培養(yǎng)的上述菌液,于37℃恒溫?fù)u床250r/m in培養(yǎng)3h左右,使其 OD600值達(dá)0.7-0.8。再加入50μl1ol/L IPTG,使終濃度達(dá)0.5mmol/l,進(jìn)行外源基因的誘導(dǎo)表達(dá)。于37℃恒溫?fù)u床250r/min,繼續(xù)培養(yǎng)4-5h后,4℃低溫離心收集菌體,棄上清,裂解菌體,95℃變性菌體蛋白。取25μl上樣,進(jìn)行SCSPA GE。

將電泳產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至PVDF膜,5%無(wú)脂牛奶封閉1h,小鼠抗人IGF-Ⅱ單克隆抗體(1:500)4℃箱孵育1hr后,加入HRP一標(biāo)記的二抗(1:1 000)室溫2 h,顯色并暴光于X線膠片。

3 結(jié)果

3.1 IGF-Ⅱ目的基因片段的RT-PCR結(jié)果與分析

小鼠的心臟組織mDNA為模板。用RT-PCR法,以olig(d T)引物反轉(zhuǎn)錄合成lGF-ⅡcDNA第一鏈,然后以合成的特異性引物和以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳顯示(圖1),擴(kuò)增帶大小(664bp)與預(yù)期的的結(jié)果一致。

3.2 重組表達(dá)質(zhì)粒的酶切與電泳鑒定

如圖2,泳道1為p ET21b-IGF-Ⅱ原核表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)EcoRI酶切及擴(kuò)增后,酶切片段與預(yù)期的一致,說(shuō)明lGF-Ⅱ基因插入進(jìn)了原核表達(dá)載體p ET21b中,泳道2為對(duì)照組,顯示空白質(zhì)粒p ET21b酶切擴(kuò)增后電泳結(jié)果。

圖1 PCR擴(kuò)增的目的片斷大小注:1為Marker;2為PCR產(chǎn)物

圖2 重組p ET21b-c IGF-Ⅱ的酶切與電泳結(jié)果注:1為p ET21b-IGF-Ⅱ原核表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)EcoRI酶切后電泳結(jié)果;2為空白質(zhì)粒p ET21b酶切后電泳結(jié)果; 3為Marker。

圖3 誘導(dǎo)表達(dá)的重組蛋白的Western blot分析注:1為未誘導(dǎo)組(陰性對(duì)照);2與3為IPTG誘導(dǎo)4 h的實(shí)驗(yàn)組。

3.3 Western blot分析

分別將未誘導(dǎo)表達(dá)的重組蛋白、兩組誘導(dǎo)表達(dá)4 h的重組蛋白進(jìn)行Western blot反應(yīng),結(jié)果如圖3所示。兩組誘導(dǎo)表達(dá)的重組菌均有明顯的免疫印跡條帶出現(xiàn),而作為陰性對(duì)照的未誘導(dǎo)組則無(wú)此條帶。

4 分析

在本實(shí)驗(yàn)中,我們通過(guò)引物設(shè)計(jì)導(dǎo)入了酶切位點(diǎn)。在完成PCR之后,純化PCR產(chǎn)物,用限制性內(nèi)切酶切割,而形成黏性末端[5]。再用同樣的內(nèi)切酶切割質(zhì)粒載體后進(jìn)行連接,從而構(gòu)建了含有IGF-Ⅱ外源片段的T-載體和p ET21b-IGF-Ⅱ原核表達(dá)質(zhì)粒載體。

大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)是目前應(yīng)用最為廣泛的經(jīng)典表達(dá)系統(tǒng)。但許多外源蛋白在大腸桿菌內(nèi)表達(dá)時(shí),往往不能白發(fā)折疊生成有一定空間結(jié)構(gòu)和特定生物功能的蛋白質(zhì),而是以一種不可溶的沉淀即包涵體的形式存在于胞內(nèi)。雖然以包涵體形式表達(dá)具有易于純化、表達(dá)產(chǎn)物較穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn),但位于包涵體中的重組蛋白往往缺乏生物話性,進(jìn)一步的包涵體體外復(fù)性產(chǎn)率也低[6-7]。

重組質(zhì)粒p ET21b-IGF-Ⅱ?qū)胨拗骶?加IPTG誘導(dǎo)進(jìn)行表達(dá)經(jīng)IPTG誘導(dǎo),以非融合形式表達(dá)了lGF-II。本研究克隆了IGF-II的基因并構(gòu)建了原核表達(dá)系統(tǒng),這為獲得大量IGF-II產(chǎn)品以便進(jìn)一步研究IGF-II的生物學(xué)活性、作用機(jī)理及開(kāi)發(fā)IGF2的臨床應(yīng)用奠定了一定的基礎(chǔ)。

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(責(zé)任編輯:劉乃生)

IGF-IIExpressed in Prokaryotic Organ ism

WANG Qing-zhong,REN Ke-yun
(Weifang Un iversity,Werfang 261061,China)

IGF-Ⅰand IGF-Ⅱare exp ressed in many organs,and have important roles in cell grow th and p roliferation.In this study,we,the target gene,IGF-Ⅱ,was cloned and amp lified By RT-PCR method from cardiac m uscle and then inserted into T-vecto r,and then inserted the exp ression vecter p ET21b.The recom binant vecto r w as indicated exp ressing IGF-Ⅱp rotein in E.coli DH5αafter induced by IPTG.We then purified reeombinant p rotein and analyzed via Western blot.

IGF-Ⅱ,RT-PCR,p rokaryotic exp ression vector,exp ression

2010-09-22

王慶忠(1961-),男,山東青州人,濰坊學(xué)院生物工程學(xué)院教授,博士。

R394 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A 文章編號(hào):1671-4288(2010)06-0103-03