曹 俊，鄒曉平，于成功，于紅剛

(1.南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院消化內(nèi)科，江蘇南京 210008;武漢大學(xué)人民醫(yī)院消化內(nèi)科，湖北武漢 430060)

胃泌素是一種多肽類激素和營(yíng)養(yǎng)因子，能促進(jìn)上消化道黏膜生長(zhǎng)。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)［1，2］胃泌素也具有促進(jìn)大腸癌生長(zhǎng)的作用，而且已在不同的細(xì)胞模型中證實(shí)了胃泌素的促增殖作用是通過與其受體(CCK-2R)結(jié)合進(jìn)行調(diào)控的，并發(fā)現(xiàn)可增加腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。核轉(zhuǎn)錄因子(nuclear factor-κB，NF-κB)異常活化研究表明與某些系統(tǒng)腫瘤的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。NF-κB可激活與浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移相關(guān)的某些重要因子的表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮其在腫瘤進(jìn)展中的重要作用［3］。尿激酶型纖溶酶原激活物(urokinase-type plasminogen activator，uPA)是一種絲氨酸蛋白酶，與其受體結(jié)合后激活纖溶酶原，轉(zhuǎn)化成纖溶酶，進(jìn)而激活金屬蛋白酶等多種蛋白酶，參與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移等過程［4］。前期研究［5］發(fā)現(xiàn) NF-κB 在大腸癌組織中持續(xù)活化，本研究進(jìn)一步研究胃泌素對(duì)大腸癌細(xì)胞NF-κB的活化及uPA表達(dá)的影響，了解胃泌素對(duì)人結(jié)腸癌的生物學(xué)效應(yīng)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 結(jié)腸腺癌細(xì)胞株Colo320細(xì)胞購(gòu)于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)。人胃泌素受體(gastrin receptor，GR)真核表達(dá)載體 pCR3.1/GR、真核表達(dá)空載體pCR3.1和胃泌素受體拮抗劑L365，260由德國(guó)波鴻大學(xué)St-Josef醫(yī)院分子消化研究室饋贈(zèng)。胃泌素(Gastrin-17，G17，美國(guó)Sigma公司)，兔抗人多克隆抗 uPA和 ECL試劑盒(美國(guó)Santa Cluz公司)，兔抗人多克隆抗NF-κB p65(美國(guó)Cell Signaling Technology公司)，二硫氨基甲酸吡啶(PDTC，美國(guó)Sigma公司)，核蛋白提取試劑盒(美國(guó) Active Motif公司)，Gel Shift Assay Systems試劑盒(美國(guó)Promega公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人結(jié)腸腫瘤細(xì)胞系Colo320細(xì)胞用10%FBS的RPMI 1640完全培養(yǎng)基置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與篩選 見參考文獻(xiàn)［6］。簡(jiǎn)言之，脂質(zhì)體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pCR3.1/GR到Colo320細(xì)胞，用濃度500 mg·L－1G418篩選。篩選出的G418抗性克隆后，通過RT-PCR和免疫印跡鑒定CCK-2R(胃泌素受體)的表達(dá)，將陽(yáng)性克隆命名為 Colo320WT。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組 分為對(duì)照組(C)、胃泌素組(G17)、胃泌素 +L365，260 組(G17+L365，260)及L365，260 組。胃泌素組用 10－8mol·L－1胃泌素干預(yù)Colo320WT細(xì)胞12 h，胃泌素加 L365，260組是應(yīng)用 10－6mol·L－1胃泌素受體拮抗劑 L365，260 預(yù)干預(yù) Colo320WT 細(xì)胞30 min，再加10－8mol·L－1胃泌素干預(yù) 12 h，L365，260 組是 10－8mol·L－1胃泌素受體拮抗劑 L365，260干預(yù)Colo320WT細(xì)胞30 min。

1.2.4 EMSA(電泳遷移率檢測(cè)) 按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，簡(jiǎn)言之，抽提細(xì)胞核蛋白，γ-32P標(biāo)記NF-κB寡核苷酸探針 (5′-AGT TGA GGG GAC TTT CCC AGG C-3′)。DNA-核蛋白結(jié)合反應(yīng)物進(jìn)行非變性聚丙烯酸凝膠電泳，將凝膠置于Whatman3MM濾紙上，干膠，X線片放射自顯影。

1.2.5 免疫印跡 Bradford方法測(cè)定蛋白濃度。在分離膠/積層膠上進(jìn)行十二烷基硫酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。脫脂奶粉室溫封閉2 h，分別用抗uPA抗體(1∶1 000)4℃孵育過夜，二抗(1∶2 000)室溫孵育1 h，ECL顯影。

1.2.6 逆轉(zhuǎn)錄-PCR 按照TRIzol試劑盒一步法提取總的RNA，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明逆轉(zhuǎn)錄合成第一條鏈cDNA，從每個(gè)樣品中取1μl用于PCR，擴(kuò)增反應(yīng)條件如下:95℃ 5 min，95℃ 30 s，56 ℃ 45 s，72℃1 min為一個(gè)循環(huán)，共25個(gè)循環(huán);0.7%瓊脂糖凝膠電泳。引物及擴(kuò)增產(chǎn)物大小如下:uPA引物:上游引物為 5′-GGGGAGCAGAGACACTAACGAC-3′，下游引物為 5′-AAGGAAGGGATAACTGGCCAAG-3′，產(chǎn)物片段大小為 350 bp;β-actin引物:上游引物為 5′-CGAGCGGGAAATCGTGCGTGACATTAAGGAGA-3′，下游引物為5′-CGTCATACTCCTGCTTGCTGATCCACATCTGC-3′，產(chǎn)物大小為479 bp，均由上海生物工程公司合成。

1.2.7 激酶阻斷實(shí)驗(yàn) Colo320WT細(xì)胞先用100 mg·L－1的NK-κB特異抑制劑二硫氨基甲酸吡啶(PDTC)預(yù)處理30 min，然后再添加 10－8mol·L－1胃泌素干預(yù)12 h，提取細(xì)胞蛋白并通過免疫印跡測(cè)定uPA的表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 胃泌素對(duì)NF-κB p65活化的影響 胃泌素干預(yù)Colo320WT細(xì)胞后，抽提細(xì)胞核提取物并用EMSA測(cè)定NF-κB p65的活性，發(fā)現(xiàn)胃泌素干預(yù)后其活性較未干預(yù)前明顯增加，當(dāng)用胃泌素拮抗劑L365，260阻斷后，活性又降低，見Fig 1。

Fig 1 Effect of gastrin-17 on NF-κB p65 activation in Colo320WT cellsC:Control;G17:gastrin17;L:L365，260

2.2 胃泌素對(duì)uPA蛋白表達(dá)的影響 胃泌素干預(yù)Colo320WT細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)uPA蛋白表達(dá)較未干預(yù)前上調(diào)。當(dāng)用胃泌素拮抗劑L365，260阻斷后，表達(dá)則下降，見Fig 2。

Fig 2 Effect of gastrin-17 on expression of uPA protein in Colo320WT cells

2.3 胃泌素對(duì)uPA的mRNA表達(dá)的影響 胃泌素干預(yù)Colo320WT細(xì)胞后，通過RT-PCR檢查uPA的mRNA表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)uPA的mRNA明顯較未干預(yù)前增加，但當(dāng)用L365，260阻斷后表達(dá)又明顯下降，見 Fig 3。

Fig 3 Effect of gastrin-17 on expression of uPA mRNA in Colo320WT cells

2.4 PDTC對(duì)uPA蛋白表達(dá)的影響 為了研究胃泌素是通過NF-κB而引起uPA表達(dá)增加，我們用NF-κB特異性阻滯劑PDTC預(yù)處理細(xì)胞，然后再用胃泌素干預(yù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PDTC預(yù)處理后uPA的表達(dá)并沒有明顯上調(diào)，這說(shuō)明了uPA的表達(dá)上調(diào)是通過NF-κB活化而引起的，見 Fig 4。

Fig 4 Effect of PDTC on expression of uPA

protein in Colo320WT cells by gastrin-17 stimulation

3 討論

胃泌素是一種多肽類激素和營(yíng)養(yǎng)因子，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)胃泌素不僅可以促進(jìn)大腸癌的發(fā)展，而且可通過活化粘著斑激酶(focal adhesion kinase，F(xiàn)AK)通路促進(jìn)大腸癌的侵襲和轉(zhuǎn)移［2，7］。NF-κB 在正常情況下存在于胞質(zhì)與其抑制物IκBα結(jié)合。當(dāng)細(xì)胞受到細(xì)菌或病毒感染、炎癥細(xì)胞因子等刺激時(shí)，IκBα將發(fā)生磷酸化并迅速降解，NF-κB就被釋放、激活并轉(zhuǎn)入細(xì)胞核內(nèi)調(diào)控一系列的基因表達(dá)。研究表明NF-κB對(duì)于基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)等與腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移有調(diào)節(jié)作用。uPA是一種絲氨酸蛋白水解酶，參與腫瘤的的侵襲和轉(zhuǎn)移等過程。另研究表明作為NF-κB通路的下游分子uPA的啟動(dòng)子區(qū)域包含有NF-κB結(jié)合位點(diǎn)，活化的NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核與uPA啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合而上調(diào)其表達(dá)［8］。

我們前期研究發(fā)現(xiàn)，胃泌素干預(yù)Colo320WT細(xì)胞12 h后，對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移達(dá)到最大效應(yīng)，故本研究我們依然采用這個(gè)時(shí)間點(diǎn)來(lái)研究胃泌素對(duì)NF-κB通路的影響［2］。Colo320結(jié)腸癌細(xì)胞是低表達(dá)胃泌素受體CCK-2R，我們穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了CCK-2R于Colo320細(xì)胞后構(gòu)建高表達(dá)胃泌素受體的Colo320WT細(xì)胞。研究中用 10－8mol·L－1胃泌素干預(yù)結(jié)腸癌細(xì)胞Colo320WT后，應(yīng)用EMSA檢查NF-κB活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)NF-κB活性較未干預(yù)時(shí)增加，但當(dāng)用 10－6mol·L－1胃泌素拮抗劑 L365，260 預(yù)干預(yù)Colo320WT后，發(fā)現(xiàn)L365，260可阻斷胃泌素的效應(yīng)，NF-κB活性沒有明顯增加，這充分說(shuō)明了胃泌素可活化NF-κB。由于 uPA是NF-κB通路的下游分子，我們檢查了uPA的mRNA和蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)胃泌素可明顯上調(diào)uPA的表達(dá)。另一方面我們通過激酶阻斷實(shí)驗(yàn)(即應(yīng)用 NF-κB特異性拮抗劑PDTC)，發(fā)現(xiàn)了添加PDTC后，胃泌素并不能使 uPA的表達(dá)增加，這也說(shuō)明了胃泌素上調(diào)uPA的表達(dá)是通過其活化NF-κB，繼而引起uPA轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的增加。

總之，本研究證明了胃泌素與其受體CCK-2R結(jié)合后，活化了結(jié)腸癌細(xì)胞Colo320WT中NF-κB通路，上調(diào)uPA的表達(dá)，參與結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展，為我們進(jìn)一步提供了防治腫瘤的新思路。

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