王 坤,鐘 軍,張丹丹,仇 萍,曾維軍

(1湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,長(zhǎng)沙 410128;2湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院,長(zhǎng)沙 410128;3湖南正清制藥集團(tuán)股份有限公司,懷化 418000)

魚腥草(Houttuynia cordata Thunb)是三白草科蕺菜屬的宿根性多年生草本植物,在中國(guó)分布廣泛,種質(zhì)資源十分豐富。巨大的種質(zhì)資源數(shù)量使得人們很難對(duì)其進(jìn)行深入研究并加以有效利用,且不清楚其資源遺傳多樣性的程度又影響了種質(zhì)資源的育種利用[1]。

相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性(sequence-related amplified polymorphism,SRAP)是一種新型的基于PCR的分子標(biāo)記系統(tǒng)。其獨(dú)特之處在于其引物設(shè)計(jì)上,上游引物和下游引物分別包含17和18個(gè)堿基,它們能優(yōu)先對(duì)基因組DNA開放閱讀框、內(nèi)含子和啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行特異擴(kuò)增,因不同基因型啟動(dòng)子、內(nèi)含子和間隔序列長(zhǎng)度不同而產(chǎn)生多態(tài)性[2],且該標(biāo)記簡(jiǎn)單、高效、高共顯性、易測(cè)序、擴(kuò)增多態(tài)性高,所能提供的生物學(xué)信息更多,故而迅速在植物遺傳多樣性分析和比較基因組學(xué)研究等方面得到廣泛應(yīng)用[3]。目前,SRAP標(biāo)記在農(nóng)作物(棉花[4]、玉米[5]、油菜[6])及蔬菜作物 (豌豆[7]、南瓜[8]、馬鈴薯[9]、蓮[10])上的應(yīng)用報(bào)道較多;在果樹柿屬[11]植物、梨 屬[12]、柑 橘[13]、核 桃[14]、石 榴[15]上 的 SRAPPCR的擴(kuò)增體系也有報(bào)道。但是關(guān)于SRAP標(biāo)記在中草藥上的報(bào)道只有川黨參[16]、玄參[17]、黃芪[18]等少數(shù)幾種,而在魚腥草上應(yīng)用研究的報(bào)道至今未見。筆者以16份不同魚腥草的資源為材料,在建立并優(yōu)化其SRAP擴(kuò)增反應(yīng)的基礎(chǔ)上,利用篩選的引物對(duì)材料進(jìn)行了遺傳多樣性分析,以期為揭示魚腥草資源間的系譜關(guān)系和遺傳多態(tài)性提供新的依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料于2009年8月取自湖南正清制藥集團(tuán)股份有限公司懷化魚腥草種質(zhì)資源圃(表1)。

1.2 儀器與試劑

UV-55紫外分光光度計(jì)(Bio-RAD),Gel Doc2000凝膠成像系統(tǒng)(Bio-RAD),Eppendorf Mastercycle gradient梯度 PCR儀 (Eppendorf),DYCZ-24B型電泳槽(北京市六一儀器廠),DYY-6C型電泳儀(北京市六一儀器廠),s700三星數(shù)碼相機(jī)。

瓊脂糖(進(jìn)口分裝),SRAP引物(北京賽百盛基因技術(shù)有限公司 ),PVP(Sigma),β-巰基乙醇(Sigma),CT AB(Amresco),100 bpDNA laddermarker(TOYOBO),丙烯酰胺、甲叉-雙丙烯酰胺、硝酸銀、甲醛均為 BBI公司產(chǎn)品,T EMED、過硫酸銨為 Promega產(chǎn)品,Taq酶(TOYOBO),dNT Ps(TaKaRa),其余為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.3 方法

(1)DNA的提取。魚腥草葉片 DNA的提取采用鐘軍改良的CTAB法[19],并稍作改動(dòng)。經(jīng) UV-55紫外分光光度計(jì)分析純度和產(chǎn)率,用0.8%瓊脂糖電泳檢測(cè)其質(zhì)量。

表1 魚腥草材料編號(hào)及來(lái)源

(2)SRAP反應(yīng)體系的優(yōu)化。每一組均以 ZY06-012 DNA為模板,以 Me5— Em4為引物組合,分別對(duì)魚腥草 PCR反應(yīng)體系中5個(gè)主要影響因素(dNTPs的濃度、模板 DNA的濃度、引物濃度、Taq酶的用量和Mg2+濃度)和擴(kuò)增體系中 2個(gè)主要影響因素(退火溫度和循環(huán)數(shù))進(jìn)行正交設(shè)計(jì)優(yōu)化。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)分別見表 2和表 3。

(3)篩選引物。選取已公布的 SRAP上游引物18條,下游引物20條(表4),組成360對(duì)引物組合,由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司合成。篩選出擴(kuò)增多態(tài)性好、條帶清晰的引物對(duì)進(jìn)行遺傳多樣性分析。

表2 魚腥草SRAP-PCR反應(yīng)體系正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表L16(45)

表3 魚腥草SRAP-PCR擴(kuò)增體系正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表L9(34)

表4 試驗(yàn)中使用的SRAP引物

(4)SRAP擴(kuò)增。以優(yōu)化后的最佳反應(yīng)體系和擴(kuò)增體系進(jìn)行,最后取2μL的擴(kuò)增產(chǎn)物,8%丙烯酰胺凝膠電泳,電壓 150 V,電泳1.5 h,然后固定、染色、顯影、停顯[20],最后用數(shù)碼相機(jī)拍照并記錄。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

選取同一引物在相同基因位點(diǎn)擴(kuò)增重復(fù)性強(qiáng)和清晰的條帶,根據(jù)條帶的有無(wú)分別記做“1”和“0”。不同引物擴(kuò)增的結(jié)果構(gòu)成原始的“0,1”二元數(shù)據(jù)矩陣,用DPS分析軟件計(jì)算魚腥草各基因型之間的 Nei’s遺傳距離,用 UPGMA程序構(gòu)建聚類圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 SRAP-PCR反應(yīng)體系及擴(kuò)增體系正交試驗(yàn)優(yōu)化分析

從圖1中可以看出,在 16組反應(yīng)中只有第 4組的電泳結(jié)果最為清晰可辨且擴(kuò)增條帶數(shù)最多,第 3組稍次之,即適合于魚腥草 SRAP最優(yōu)的反應(yīng)體系為:25 μL的反應(yīng)體系中,模板 DNA量 40 ng、Mg2+濃度 2.0 mmol/L、上下游引物 37.5 ng/L、dNTPs0.1 mmol/L以及 2 U Taq酶。從圖 2結(jié)果來(lái)看,第 9組的條帶比其他組更清楚,條帶數(shù)更多,所以適合于魚腥草SRAP最優(yōu)的擴(kuò)增體系為第 9組擴(kuò)增體系,即退火溫度 53℃,循環(huán)數(shù)為 35。

2.2 遺傳多樣性分析

從360對(duì)引物組合中篩選出118對(duì)擴(kuò)增條帶清晰、重復(fù)性好的引物組合進(jìn)行 PCR擴(kuò)增,共擴(kuò)增出 7 582個(gè)條帶,其中多態(tài)性條帶 6 590個(gè),多態(tài)率 86.92%。SRAP標(biāo)記的多態(tài)性見表5,擴(kuò)增產(chǎn)物的分子量為50～2 500 bp。 其中引物組合 Me9-GA18共擴(kuò)增出 79個(gè)基因位點(diǎn),多態(tài)性位點(diǎn)63,多態(tài)位點(diǎn)比率為79.75%;引物組合Me16-Em9共擴(kuò)增出基因位點(diǎn)105個(gè),其中多態(tài)性位點(diǎn)73個(gè),多態(tài)位點(diǎn)比率為 69.52%。

2.3 魚腥草基因型SRAP特異性缺失標(biāo)記及特異性標(biāo)記

在 16個(gè)魚腥草基因型中,ZY06-028魚腥草在Me9-GA18(圖3)引物對(duì)擴(kuò)增時(shí)缺失一條250 bp左右擴(kuò)增帶,可以作為ZY06-028魚腥草品種鑒定的特異標(biāo)記。而 ZY06-016和 ZY06-028魚腥草約在550 bp處共同缺失一條擴(kuò)增帶,其余品種均無(wú)缺失。在 Me8-Em10引物擴(kuò)增產(chǎn)物中出現(xiàn)了兩個(gè)特異性標(biāo)記的條帶,分別是 ZY06-42在 300 bp處的一條帶和 ZY06-01在 450 bp處的一條帶(圖4)。這些特異性缺失標(biāo)記和特異性標(biāo)記都可以作為魚腥草品種鑒定和形態(tài)學(xué)分類的重要依據(jù)。

圖1 魚腥草SRAP-PCR反應(yīng)體系正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化結(jié)果

表5 SRAP上、下游引物、擴(kuò)增總帶數(shù)及多態(tài)性帶數(shù)

2.4 基因型間的親緣關(guān)系

應(yīng)用 DPS軟件,根據(jù)“0,1”數(shù)據(jù)矩陣,計(jì)算的遺傳距離在 0.0536～0.4040。其中 ZY06-021和 ZY06-05之間的遺傳距離最小為 0.0536,ZY06-016和 ZY06-024之間的遺傳距離最遠(yuǎn)為0.4040。ZY06-016為在湖南攸縣網(wǎng)嶺北平村采集的材料,ZY06-024為在湖南醴陵泗汾采集的材料。圖5為應(yīng)用UPGMA程序建立的16個(gè)魚腥草基因型的聚類圖。根據(jù)聚類圖可看出,在遺傳距離 0.31處,可將 16份魚腥草材料分為三大類,其中ZY06-024魚腥草為第一類,ZY06-01為第二類,第三類包括了其余的14份材料,這14份材料包括了兩個(gè)亞類,第一亞類中包含有 ZY06-016,ZY06-02,ZY06-021,ZY06-05,ZY06-36,ZY06-42,ZY06-028,共 7份材料;第二亞類中包含有 ZY06-34,ZY06-012,ZY06-43,ZY06-018,ZY06-32,WYC-01,WYC-02,也是 7份材料。在16份材料中遺傳關(guān)系較近的有 ZY06-021和ZY06-05,ZY06-43和 ZY06-018,WYC-01和 WYC-02。從此結(jié)果可以看出,同一地區(qū)的品種,如湖南攸縣的 4份資源:ZY06-016,ZY06-012,ZY06-021,ZY06-018并沒有聚到一類,且同為紅稈的ZY06-05和ZY06-01的遺傳關(guān)系還比較遠(yuǎn)。這或許能夠說(shuō)明魚腥草基因型間的遺傳關(guān)系很復(fù)雜。

圖5 16份魚腥草品種資源的SRAP聚類圖

3 討 論

本試驗(yàn)中選擇118對(duì)引物組合,對(duì) 16個(gè)魚腥草品種資源進(jìn)行了多樣性分析,其揭示的多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)高達(dá) 86.92%。由此可見,作為一種新型的分子標(biāo)記,SRAP技術(shù)在魚腥草資源的系統(tǒng)分類、親緣關(guān)系鑒定、品種鑒別、親本選擇等方面具有潛在的應(yīng)用前景。

SRAP標(biāo)記是一種基于 PCR技術(shù)的分子標(biāo)記,擴(kuò)增結(jié)果易受到反應(yīng)條件及擴(kuò)增條件的影響,因此針對(duì)不同的試材及實(shí)驗(yàn)條件需要優(yōu)化反應(yīng)體系。本試驗(yàn)進(jìn)行了不同影響因子的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化,試驗(yàn)結(jié)果表明,適合于魚腥草 SRAP最優(yōu)的反應(yīng)體系為:25μL的反應(yīng)體系中,模板DNA量40 ng,Mg2+濃度 2.0 mmol/L,上下游引物 37.5 ng/L,dNTPs0.1 mmol/L以及 2 U Taq酶;適合于魚腥草SRAP最優(yōu)的擴(kuò)增體系為:退火溫度 53℃,循環(huán)數(shù)為 35。此結(jié)果與南瓜[8]、柿子[11]、梨[12]等建立的 SRAP標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系中的各參數(shù)相比,存在一定的差別。其原因可能是不同物種的基因組存在很大的差別,所需的反應(yīng)體系也會(huì)有所不同,也可能是不同公司的藥品儀器導(dǎo)致的差別。

本實(shí)驗(yàn)在對(duì) 16個(gè)魚腥草品種的 SRAP分析中發(fā)現(xiàn),有些品種用特定的引物對(duì)擴(kuò)增以后,會(huì)出現(xiàn)一些特異性缺失的條帶及特異性的條帶,這些特異性缺失條帶和特異性的條帶可為魚腥草的品種鑒定提供必要的依據(jù)。例如,引物對(duì)組合Me9-GA18-250 bp缺失條帶是 ZY06-028魚腥草的特異缺失標(biāo)記,Me9-GA18-550 bp缺失條帶是ZY06-016和ZY06-028魚腥草的特異缺失標(biāo)記,在引物對(duì)組合Me8-Em10中ZY06-42和 ZY06-01分別在 300 bp和 450 bp處出現(xiàn)了一條特異性的條帶。

16個(gè)魚腥草基因型中 ZY06-016和 ZY06-024的遺傳關(guān)系最遠(yuǎn),ZY06-021和 ZY06-05,ZY06-43和ZY06-018,WYC-01和 WYC-02遺傳關(guān)系較近,同時(shí)可在遺傳距離0.31處分為3個(gè)類群,其中 ZY06-024和ZY06-01魚腥草與其它基因型顯著不同,分別單獨(dú)聚為一類,其余的 14個(gè)魚腥草品種聚為一大類,而這一大類又可在遺傳距離0.28處分為兩個(gè)亞類。從聚類結(jié)果中可以發(fā)現(xiàn),同一地區(qū)的品種(如湖南攸縣的 4個(gè)品種:ZY06-016,ZY06-012,ZY06-021,ZY06-018)沒有聚到一起,不僅如此,與形態(tài)學(xué)指標(biāo)莖稈顏色、莖稈長(zhǎng)度等分類也有很大不同。吳衛(wèi)[1]等人對(duì)四川地區(qū)92份魚腥草材料進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)魚腥草染色體數(shù)目的變化范圍很大,在 36～126之間變化,且即使在同一地區(qū)不同村鎮(zhèn)上的魚腥草染色體數(shù)目亦有很大差別。例如,同是四川劍閣的魚腥草材料,但染色體數(shù)目就有 72條,82條,84條,86條之別。這一結(jié)論或許能對(duì)上述結(jié)果做出較好的解釋,即魚腥草基因型間的遺傳關(guān)系非常復(fù)雜。

4 結(jié) 論

SRAP分子標(biāo)記能夠很好的用于魚腥草基因型遺傳多樣性分析。 ZY06-024和 ZY06-01與其他 14份材料的基因型顯著不同,且這 16份材料的分子標(biāo)記結(jié)果表明,在同一地區(qū)引進(jìn)的材料并沒有很好聚到一類中,這或許能夠說(shuō)明魚腥草的基因型受生態(tài)環(huán)境的影響比較小。同時(shí)各品種間聚類結(jié)果與按照莖稈顏色、莖稈長(zhǎng)度等形態(tài)學(xué)指標(biāo)分類也不太一致(未發(fā)表),表明了魚腥草各基因型遺傳關(guān)系的復(fù)雜性。

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