鄧啟華,傅 力,王德良,劉 霞,林智平,賈鳳超

(1新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院,新疆烏魯木齊,830052)

2(北京燕京啤酒股份有限公司,北京,101300)

3(中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院,北京,100027)

啤酒糟是啤酒企業(yè)最大宗的副產(chǎn)物之一,資源非常豐富,其主要成分是蛋白質(zhì)、纖維組分和其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),因此,啤酒糟的綜合利用一直受到國(guó)內(nèi)外研究工作者的重視[1-4]。但是啤酒糟中的纖維含量較高,中性洗滌纖維 (NDF)含量高達(dá) 50%(水分低于 10%的干糟)以上,包括纖維素、半纖維素和木質(zhì)素,它們之間相互形成緊密的結(jié)構(gòu),導(dǎo)致難以被降解利用,作為一種飼料原料在單胃動(dòng)物 (如豬)上的使用范圍非常有限[5],大大降低了啤酒糟的潛在價(jià)值。因此在進(jìn)一步開發(fā)利用前有必要對(duì)啤酒糟進(jìn)行預(yù)處理,降低啤酒糟的纖維含量。

纖維質(zhì)原料的預(yù)處理技術(shù)目前研究較多,包括物理法 (如粉碎、輻射、爆破,擠壓膨化等)、化學(xué)法 (酸法、堿法、氧化法和有機(jī)溶劑等)、生物法 (微生物腐朽法和酶解法)和聯(lián)合法 (物化聯(lián)合、物生聯(lián)合)等[6-11]。這些預(yù)處理技術(shù)在啤酒糟研究開發(fā)中很少應(yīng)用,本研究主要采用超微粉碎、蒸汽爆破和纖維素酶解法預(yù)處理技術(shù),探討預(yù)處理前后啤酒糟纖維組分的變化。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

干啤酒糟:取自北京燕京啤酒股份有限公司;纖維素酶,夏盛酶制劑公司;3,5-二硝基水楊酸,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

HZS-H水浴振蕩器,哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司;HG53鹵素水分測(cè)定儀,METTLER TOLEDO公司;UN IC 2100分光光度計(jì);QUANTA 200型環(huán)境電子掃描顯微鏡,FEI公司;QBS-80型蒸汽爆破設(shè)備,鶴壁市正道重機(jī)廠;FDV超微粉碎機(jī),佑崎有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 啤酒糟主要營(yíng)養(yǎng)成分的檢測(cè)

由農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所檢測(cè)中心檢測(cè)。

1.2.2 啤酒糟的預(yù)處理

對(duì)照啤酒糟:不經(jīng)任何處理,干燥至恒重,備用。

蒸汽爆破啤酒糟:爆破前對(duì)爆破汽缸蒸汽預(yù)熱至100℃左右,往汽缸填 200 g干啤酒糟進(jìn)行爆破,爆破時(shí)間均為 60 s,爆破壓力從 1-3 MPa共處理了 7個(gè)條件 ,由強(qiáng)到弱分別標(biāo)記為 1#、2#、3#、4#、5#、6#、7#。爆破后的啤酒糟經(jīng)干燥至恒重,備用。

超微粉碎啤酒糟:50 g干啤酒糟直接放入 FDV超微粉碎機(jī)粉碎 3 min,干燥至恒重,備用。

1.2.3 啤酒糟中還原糖檢測(cè)

采用 3,5-二硝基水楊酸比色法,簡(jiǎn)稱 DNS法,具體步驟參見QB 2583-2003,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4 啤酒糟中纖維組分的檢測(cè):

NDF、ADF和 ADL測(cè)定根據(jù) GB/T20806-2006和 GB/T20805-2006方法測(cè)定。其中,在每一次抽濾后的干燥過程,使用 HG53鹵素水分測(cè)定儀代替方法中的烘箱干燥,其他不變,其中 NDF-ADF=半纖維素;ADF-ADL-灰分 =纖維素,ADL=酸洗木質(zhì)素。檢測(cè)原理及其流程簡(jiǎn)圖如圖1所示。

圖1 啤酒糟纖維組分檢測(cè)流程簡(jiǎn)圖

1.2.5 啤酒糟中還原糖的浸提

5 g啤酒糟用 100 mL的緩沖液制成 5%濃度的溶液,在 50℃水浴振蕩器中浸提 30 min,轉(zhuǎn)速為 100 r/min,最后在 5 000 r/min下離心 10 min,上清液按照DNS方法檢測(cè)還原糖,結(jié)果用 mg/mL表示,下同,若浸提液中還原糖濃度較高,進(jìn)行適當(dāng)稀釋后進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.6 啤酒糟的電子掃描顯微鏡 (SEM)觀察

樣品直接粘臺(tái),通過離子點(diǎn)濺射樣品表面噴鍍一層薄薄的導(dǎo)電金屬電子層 (即噴金),放入掃描電鏡樣品室進(jìn)行樣品表面形貌觀察。

1.2.7 酶解啤酒糟正交試驗(yàn)

根據(jù)單因子試驗(yàn)結(jié)果對(duì)啤酒糟酶解條件進(jìn)行優(yōu)化,選擇加酶量、反應(yīng)時(shí)間、底物濃度、反應(yīng)溫度作為實(shí)驗(yàn)因子,每個(gè)因子選擇 3個(gè)水平,以酶解液中的還原糖含量作為評(píng)價(jià)指標(biāo),采用 L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì),設(shè)計(jì)方案見表 1。

表1 酶解啤酒糟正交試驗(yàn)因素水平表

2 結(jié)果與討論

2.1 啤酒糟的主要營(yíng)養(yǎng)成分

表2 啤酒糟的營(yíng)養(yǎng)成分 %

圖2 不同預(yù)處理?xiàng)l件下的電鏡掃描圖(25,1 000分別為 25×和 1 000×視角下的電鏡掃描圖)

2.2 預(yù)處理前后啤酒糟纖維結(jié)構(gòu)的變化

通過觀察圖2的啤酒糟電鏡掃描圖可以發(fā)現(xiàn),未處理啤酒糟中呈規(guī)則片段結(jié)構(gòu)較多,同時(shí)結(jié)構(gòu)非常致密,超微粉碎中規(guī)則形狀纖維物質(zhì)較少,但是纖維的結(jié)構(gòu)很致密,說明超微粉碎技術(shù)對(duì)啤酒糟的纖維形態(tài)結(jié)構(gòu)影響很小。經(jīng)過蒸汽爆破后的啤酒糟規(guī)則形狀片段也較少,且纖維片段變得蓬松,1 000×視角下可以明顯看到纖維原來的致密結(jié)構(gòu)已經(jīng)松弛,呈現(xiàn)了多孔隙結(jié)構(gòu),這種結(jié)構(gòu)有利于酶的作用,纖維素酶可以直接接觸到啤酒糟纖維內(nèi)部的作用點(diǎn)。

2.3 預(yù)處理前后啤酒糟還原糖和 NDF含量的變化

啤酒糟中纖維結(jié)構(gòu)的破壞,可能增加啤酒糟中還原糖的含量。利用 1.2.5所描述的浸提條件,浸提液用 DNS法檢測(cè)還原糖,結(jié)果如圖3所示。

圖3 預(yù)處理前后還原糖的變化

由圖3可知,未處理啤酒糟浸提液的還原糖含量很低,超微粉碎預(yù)處理后的啤酒糟浸提液的還原糖變化不大,說明超微粉碎預(yù)處理后啤酒糟的纖維結(jié)構(gòu)沒有得到根本破壞。蒸汽爆破預(yù)處理后的啤酒糟樣品,隨著處理強(qiáng)度的提高,還原糖含量有逐漸升高的趨勢(shì)。值得注意的是,2#糟的處理強(qiáng)度低于 1#糟,但是還原糖含量卻更高,蒸汽爆破處理強(qiáng)度不能太高。

圖4 預(yù)處理前后啤酒糟 NDF的變化

NDF指標(biāo)包含了幾乎所有的纖維素、半纖維素、木質(zhì)素等所有纖維組分,因此這個(gè)指標(biāo)可代表啤酒糟中總纖維含量。從圖4可以發(fā)現(xiàn),未處理的啤酒糟NDF值最高,達(dá) 62.9%,超微粉碎后的啤酒糟樣品NDF變化很小,也說明超微粉碎預(yù)處理技術(shù)在降低啤酒糟纖維含量作用非常有限;蒸汽爆破后的啤酒糟樣品的NDF值變化最明顯,隨著爆破處理強(qiáng)度的提高,NDF含量逐步降低。1#降低到了 35.5%,降低率達(dá) 43.6%。從纖維素、半纖維素、木質(zhì)素這些指標(biāo)可以發(fā)現(xiàn),預(yù)處理前后的啤酒糟半纖維素含量變化最為顯著;纖維素變化不大,蒸汽爆破后的啤酒糟 ADL含量有所增加,這可能是由于蒸汽爆破處理后物料的損失以及一些半纖維素又與木質(zhì)素之間形成假木質(zhì)素造成。

2.3 纖維素酶水解啤酒糟的條件摸索

2.3.1 不同加酶量對(duì)啤酒糟酶解的影響

加酶量對(duì)酶促反應(yīng)具有很大影響,加酶量不足,則底物不會(huì)被充分水解;充足的加酶量使底物得到充分降解,然而過量加酶量必然導(dǎo)致生產(chǎn)成本增加。此次試驗(yàn)酶解條件:底物濃度 5%,酶濃度從 1-240 U/g,pH自然,50℃恒溫水浴反應(yīng)時(shí)間 6 h,轉(zhuǎn)速 100 r/min,結(jié)果如圖5所示。

表3 預(yù)處理前后啤酒糟纖維組分的變化 %

圖5 不同加酶量對(duì)啤酒糟酶解的影響

從圖5可以發(fā)現(xiàn),隨著酶濃度的提高,酶解液中還原糖含量有明顯增長(zhǎng)。但是酶濃度從 120 U/g到240 U/g時(shí),還原糖增長(zhǎng)趨勢(shì)不再明顯,因此選擇酶濃度為 60 U/g、120 U/g、180 U/g作為正交優(yōu)化的條件。

2.3.2 反應(yīng)時(shí)間對(duì)啤酒糟酶解的影響

基于酶反應(yīng)時(shí)間對(duì)水解效果有顯著的影響,同時(shí)基于酶的穩(wěn)定性是一個(gè)限制因素,經(jīng)過一定酶促反應(yīng)時(shí)間后,酶的活性可能降低;同時(shí)考慮到將來可能的生產(chǎn)應(yīng)用性,過長(zhǎng)時(shí)間處理后會(huì)徒增生產(chǎn)周期,所以應(yīng)該維持合理的酶解時(shí)間,因此酶水解時(shí)間是一個(gè)重要研究因素。在底物濃度 5%,酶濃度 120 U/g,pH自然、轉(zhuǎn)速 100 r/min的條件下,本研究在 50℃恒溫水浴條件下,分別反應(yīng) 1-7 h,研究反應(yīng)時(shí)間對(duì)啤酒糟酶解的影響,結(jié)果如圖6所示。

圖6 反應(yīng)時(shí)間對(duì)酶解效果的影響

從圖6可以看出,還原糖量隨著時(shí)間的增加而不斷增加,在開始一段時(shí)間內(nèi),還原糖量增加趨勢(shì)明顯,而隨著時(shí)間的延長(zhǎng),增加趨勢(shì)變得平穩(wěn),這符合一般酶水解反應(yīng)規(guī)律,可能主要是由酶部分失活和產(chǎn)物抑制所導(dǎo)致。因此啤酒糟的酶解反應(yīng)時(shí)間控制在 5-7h比較合適。

2.3.3 底物濃度對(duì)啤酒糟酶解的影響

底物濃度對(duì)酶促反應(yīng)具有很大的影響,當(dāng)?shù)孜餄舛冗h(yuǎn)遠(yuǎn)小于 Km值時(shí),酶反應(yīng)速度與底物濃度成線性關(guān)系,提高底物濃度可以提高反應(yīng)速度;而在低底物濃度時(shí),底物中含有的可被有效水解的纖維組分較少,因此最終得到的水解液中的還原糖含量較少,因此從生產(chǎn)的角度來考慮,底物濃度高對(duì)生產(chǎn)成本的降低有好處。當(dāng)反應(yīng)進(jìn)行一段時(shí)間后,底物總量減少,產(chǎn)物的量增加,對(duì)酶促反應(yīng)會(huì)產(chǎn)生抑制,不利于反應(yīng)向正方向進(jìn)行。本研究的酶解條件:底物濃度 2.5%-20%,酶濃度 120 U/g,pH自然,50℃恒溫水浴反應(yīng) 5 h,轉(zhuǎn)速 100 r/min,結(jié)果如圖7所示。

在研究底物濃度對(duì)酶解效果的影響試驗(yàn)中,發(fā)現(xiàn)不同的底物濃度,酶解過濾后的上清液體積變化很大,這對(duì)還原糖的檢測(cè)結(jié)果影響很大,因此在此實(shí)驗(yàn)中,把上清液統(tǒng)一稀釋到 100 mL,稀釋后的還原糖濃度檢測(cè)值作為檢測(cè)結(jié)果來表示。由圖7可知,隨著底物濃度的增加,還原糖含量也逐步增加,在底物濃度為 10%達(dá)到最大值。隨后底物濃度再提升,其還原糖濃度有所下降。因此,選擇底物濃度控制在 5%-10%之間比較合適。

圖7 底物濃度對(duì)酶解效果的影響

2.3.4 pH值對(duì)啤酒糟酶解的影響

pH對(duì)酶促反應(yīng)也有很大的影響,每一種酶都有一個(gè)最適 pH。本實(shí)驗(yàn)用的纖維素酶的說明書上的最適 PH為 4.8。此次試驗(yàn)的酶解條件:底物濃度 5%,酶濃度 120 U/g,pH 3.6-7.7,50℃恒溫水浴反應(yīng) 5 h,轉(zhuǎn)速 100 r/min,結(jié)果如圖8所示。

圖8 不同 pH值對(duì)啤酒糟酶解的影響

通過上圖可知,通過緩沖液調(diào)節(jié) pH時(shí),pH在5.2左右時(shí)酶解液中還原糖含量最高。值得注意的是,pH 5.2時(shí)的還原糖含量低于 pH在自然條件 (即不用緩沖液調(diào) pH值,直接用純凈水配制,此時(shí) pH約6.7左右)下的值,當(dāng)把緩沖液 pH調(diào)到 6.8時(shí),其酶解液中的還原糖只有 1.1 mg/mL,遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于 pH自然的情況。這說明,pH緩沖液中含有限制纖維素酶的因子。因此,酶解啤酒糟的 pH值就采用自然條件。

2.3.5 溫度對(duì)啤酒糟酶解的影響

溫度對(duì)酶促反應(yīng)有很大的影響,在一定范圍內(nèi),升高溫度可以加快酶-底物中間體分解轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的速度;然而溫度過高會(huì)降低酶反應(yīng)速率,因?yàn)槊甘堑鞍踪|(zhì),溫度過高會(huì)降低酶的穩(wěn)定性,使其失活,從而影響酶水解的最終作用效果。此次試驗(yàn)的酶解條件:底物濃度 5%,酶濃度 120 U/g,pH自然,40-60℃恒溫水浴反應(yīng) 5 h,轉(zhuǎn)速 100 r/min,結(jié)果如圖9所示。

圖9 溫度對(duì)啤酒糟酶解的影響

從圖9可見,50℃時(shí)酶解效果最好,60℃時(shí)還原糖含量下降很快,酶解啤酒糟的最適溫度在 50℃左右,而纖維素酶在 60℃下失活較快。因此,酶解啤酒糟是溫度應(yīng)當(dāng)控制在 45-55℃合適。

2.3.6 酶解啤酒糟正交試驗(yàn)

根據(jù)表 2的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案進(jìn)行試驗(yàn),正交試驗(yàn)結(jié)果見表 4。

表4 酶解啤酒糟正交試驗(yàn)結(jié)果表

從表 4可以很直觀的看出,影響啤酒糟酶解的影響因素的主次關(guān)系分別為:A＞C＞D＞B,最佳酶解條件組合是:A3C2D2B3.這和前面單因素試驗(yàn)摸索的條件基本一致,也和正交試驗(yàn)中的最大值的酶解條件基本一致,說明這幾個(gè)因素之間不存在明顯的交互作用。在進(jìn)行方差分析之前,因?yàn)樽饔脮r(shí)間的影響最低,因此把它作為方差分析中的空閑因子,即誤差列。方差分析結(jié)果見表 5,可以得到,酶濃度和底物濃度是酶解啤酒糟的顯著影響因子。通過正交試驗(yàn),得到最佳的酶解啤酒糟的條件為:酶濃度 180 U/g,底物濃度為 10%,溫度為 50℃,作用時(shí)間為 6 h,pH自然。

表5 酶解啤酒糟正交試驗(yàn)方差分析表

2.5.7 最佳酶解條件下的啤酒糟的酶解效果

根據(jù)最佳酶解條件,對(duì)未處理啤酒糟、超微粉碎啤酒糟、蒸汽爆破的 1#、2#、7#啤酒糟進(jìn)行酶解,結(jié)果如表 6所示。

從表 6可以明顯看出,在最佳酶解條件下,各種糟的酶解效果均得到了明顯提高。1#啤酒糟的還原糖凈增值達(dá) 12.77 mg/mL,蒸汽爆破后的啤酒糟的NDF值與酶解前對(duì)比,特別是 1#、2#,基本沒有變化,但是其 NDF值也比未處理啤酒糟經(jīng)酶解后的 NDF值低。說明,蒸汽爆破預(yù)處理技術(shù)結(jié)合纖維素酶水解技術(shù),可以明顯降低啤酒糟中的纖維含量,同時(shí)還原糖含量也得到大幅提高。

表6 最佳酶解條件下啤酒糟的酶解效果

3 結(jié)論

蒸汽爆破預(yù)處理技術(shù)能有效的破壞啤酒糟纖維致密的形態(tài)結(jié)構(gòu),使其變得松弛,呈現(xiàn)多孔隙結(jié)構(gòu),而超微粉碎預(yù)處理技術(shù)對(duì)啤酒糟的結(jié)構(gòu)作用效果很小;超微粉碎預(yù)處理后的啤酒糟其還原糖含量變化較小,NDF降低率僅 10.5%;蒸汽爆破預(yù)處理后的啤酒糟還原糖含量明顯增加,NDF降低率高達(dá) 43.6%,作用效果非常明顯;經(jīng)預(yù)處理的啤酒糟其主要變化的纖維組分是半纖維素,纖維素和木質(zhì)素含量變化不明顯;纖維素酶解啤酒糟的最佳條件是:酶濃度 180 U/g,底物濃度為 10%,溫度為 50℃,作用時(shí)間為 6 h,pH自然;蒸汽爆破技術(shù)結(jié)合纖維素酶解技術(shù)可以有效的降低啤酒糟中的纖維含量,同時(shí)提高了還原糖含量。

[1] Pirkko Forssell,Hanna Kontkanen,Henk A Schols,et al.Hydrolysisof Brewers’spent grain by carbohydrate degrading enzymes[J].Journal of the Institute of Brewing,2008,(4):306-314.

[2] Mussatto S I,Dragone G,Roberto IC.Brewers’spent grain:generation,characteristics and potential applications[J].Journal of Cereal Science,2006(1):1-14.

[3] Mussatto S I,Marcela F,Dragone G,et al.Brewer’s spent grain as raw material for lactic acid p roduction by Lactobacillus delbrueckii[J].Biotechnology Letters,2007(12):1 973-1 976.

[4] Inge Celus,Kristof Brijs,Jan A Delcour.Enzymatic hydrolysis of brewers’spent grain proteins and technofunctional propertiesof the resulting hydrolysates[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2007(21):8 703-8 710.

[5] 姚軍虎 .動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料 [M]:北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社,2001:29-33.

[6] 趙健 .纖維質(zhì)原料預(yù)處理技術(shù)[J].生物產(chǎn)業(yè)技術(shù),2008(1):66-71.

[7] 劉超鋼,劉力,余世袁 .預(yù)處理對(duì)啤酒麥糟酶水解的影響[J].林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè),1995(1):67-71.

[8] 李家璜,陳彪,歐陽(yáng)平凱 .蒸爆技術(shù)在植物纖維素預(yù)處理中的應(yīng)用[J].上?；?2000,18:4-5.

[9] 羅鵬,劉忠 .蒸汽爆破預(yù)處理?xiàng)l件對(duì)麥草酶水解影響的研究 [J].林業(yè)科技,2007(5):37-40.

[10] 黃大鵬,丁冉峰 .機(jī)械預(yù)處理對(duì)纖維素酶降解的影響[J].西南民族學(xué)院學(xué)報(bào)·自然科學(xué)版,2008(5):960-965.

[11] 王堃,蔣建新,宋先亮 .蒸汽爆破預(yù)處理木質(zhì)纖維素及其生物轉(zhuǎn)化研究進(jìn)展 [J].生物質(zhì)化學(xué)工程,2006(11):37-42.