陳 櫻 孟 東 孫 培 王寶利 鄧為民 姚 智

糖尿病細(xì)菌感染一直是困擾糖尿病患者和廣大醫(yī)生的難題，雖然有大量廣譜抗生素應(yīng)用于臨床，但感染的發(fā)生率仍呈增高的趨勢，感染引起的糖尿病患者死亡仍占較高比例[1]。研究表明，糖尿病高血糖可以影響單核細(xì)胞的趨化、黏附作用[2-3]，促進(jìn)細(xì)胞調(diào)亡。本研究旨在探討高糖狀態(tài)下，金黃色葡萄球菌（金葡菌）對(duì)THP-1人單核細(xì)胞表達(dá)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）和白細(xì)胞介素（IL）-1β的影響，以期從細(xì)胞免疫學(xué)角度了解糖尿病患者感染的發(fā)病機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 （1）單核細(xì)胞和培養(yǎng)試劑：人單核細(xì)胞株THP-1購自北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院。RPMI1640培養(yǎng)液為美國GIBCO公司產(chǎn)品，胎牛血清（FBS）為美國Hyclone公司產(chǎn)品。（2）菌種和調(diào)理素：金葡菌標(biāo)準(zhǔn)菌26001株（天津市金章科技發(fā)展有限公司），普通培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)18 h。挑取單個(gè)菌落，用生理鹽水將標(biāo)準(zhǔn)菌株制成約1.5×108CFU/mL（CFU：集落形成單位）細(xì)菌懸液，使用新鮮人混合血清調(diào)理1.5 h備用。（3）iNOS、IL-1β表達(dá)測定用試劑：TRIzol總RNA分離試劑購自美國Promega公司；RT-PCR試劑盒為美國LIFE TECHNOLOGIES公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組 PRMI1640培基體外培養(yǎng)單核細(xì)胞株THP-1，采用 2×2析因分析實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，以高糖（A）、細(xì)菌（B）2個(gè)因素，每個(gè)因素2個(gè)水平交叉分為4組，分別為對(duì)照組（5.5 mmol/L葡萄糖）、高糖組（25.0 mmol/L葡萄糖）、細(xì)菌組（1.5×107CFU/mL金葡菌+5.5 mmol/L葡萄糖）和高糖細(xì)菌組（1.5×107CFU/mL金葡菌+25.0 mmol/L葡萄糖）。分組細(xì)胞首先以上述2種濃度的葡萄糖培養(yǎng)72 h，再移至六孔培養(yǎng)板，同時(shí)細(xì)菌組和高糖細(xì)菌組加入金葡菌，調(diào)整細(xì)胞/細(xì)菌比例為1∶15，置37℃，270 r/min振蕩孵育1.5 h。測定iNOS和IL-1β的表達(dá)情況。

1.2.2 iNOS表達(dá)測定 用TRIzol總RNA分離試劑提取細(xì)胞RNA，用半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（SQ-RT-PCR）法檢測iNOS表達(dá)。引物：上游5′-CCAGCTAGCCAAAGTCACCA T-3′，下游 5′-GTCTCGGAGCCATACAGGATT-3′，擴(kuò)增片段長 354 bp；GAPDH: 上游 5′-AGTCCACTGGCGTCTTCAC-3′，下游 5′-TGATCTTGAGGCTGTTGTC-3′，擴(kuò)增片段長 240 bp。iNOS表達(dá)產(chǎn)物電泳結(jié)果采用GeneSnap凝膠圖像采集分析系統(tǒng)（SynGene公司產(chǎn)品）拍照，對(duì)凝膠中的特異性條帶進(jìn)行掃描，用凝膠圖像分析軟件分析，測定其相對(duì)光密度，計(jì)算各因子與GAPDH的光密度比值作為半定量指標(biāo)。iNOS基因的PCR擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，62℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)，72℃10 min。

1.2.3 IL-1β 表達(dá)測定 IL-1β 引物：上游5′-CATCCAGCT TCAAATCTCAC-3′，下游 5′-ACCACTTGTTGGCTTATGTT-3′，擴(kuò)增片段長333 bp。IL-1β基因PCR擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性 5 min，94℃變性 30 s，50℃退火 30 s，72℃延伸 30 s，共35個(gè)循環(huán)，72℃10 min。GAPDH和反應(yīng)產(chǎn)物分析同1.2.2。

2 結(jié)果

2.1 單變量多因素方差分析結(jié)果 高糖和細(xì)菌及兩者交互效應(yīng)均影響THP-1人單核細(xì)胞表達(dá)iNOS和 IL-1β，見表1、2。

2.2 單因素方差分析結(jié)果 4組組間iNOS、IL-1β表達(dá)水平比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F分別為49.87、44.63，均P<0.01）。組間的多重比較結(jié)果顯示，高糖組與對(duì)照組相比細(xì)胞表達(dá)iNOS和IL-1β均減弱；細(xì)菌組與對(duì)照組比較iNOS和IL-1β表達(dá)均增高；與高糖組比較，高糖細(xì)菌組IL-1β表達(dá)增高，iNOS表達(dá)變化不明顯，見表1、3。

表1 金葡菌對(duì)高糖狀態(tài)下THP-1人單核細(xì)胞表達(dá)iNOS和 IL-1β 的影響 （n=5，±s）

表1 金葡菌對(duì)高糖狀態(tài)下THP-1人單核細(xì)胞表達(dá)iNOS和 IL-1β 的影響 （n=5，±s）

分組對(duì)照組高糖組細(xì)菌組高糖細(xì)菌組iNOS mRNA/GAPDH 0.645±0.157 0.295±0.085 1.328±0.216 0.377±0.089 IL-1β mRNA/GAPDH 1.154±0.150 0.450±0.082 1.358±0.161 1.048±0.147

表2 多因素方差分析結(jié)果

表3 單因素方差分析組間多重比較的q值

3 討論

嚴(yán)重感染是糖尿病患者死亡的重要原因之一[4]。糖尿病患者由于血糖升高，蛋白代謝紊亂，免疫功能低下，抵抗力降低等因素，極易造成各類感染，其中呼吸系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)、膽道及皮膚軟組織的感染率分別是非糖尿病患者的2～5倍[1]。且糖尿病患者在高血糖狀態(tài)下，感染往往不易控制[5]。因此，研究高糖狀態(tài)下免疫細(xì)胞的功能有助于了解糖尿病感染的機(jī)制。

iNOS是單核細(xì)胞產(chǎn)生一氧化氮（NO）的主要限速酶。NO是體內(nèi)重要的生物活性分子和信號(hào)分子。正常情況下，單核細(xì)胞釋放的NO具有重要的保護(hù)機(jī)體的作用。筆者先前研究表明，高糖可以抑制內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）[6]。IL-1β是一個(gè)多效性促炎細(xì)胞因子，可由巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞等產(chǎn)生，能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞合成、表達(dá)細(xì)胞間黏附分子（ICAM）-1和血管細(xì)胞黏附分子（VCAM）-1，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞釋放血小板衍生生長因子（PDGF）、堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）等促有絲分裂素，同時(shí)促進(jìn)多形核白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞黏附并協(xié)同其刺激內(nèi)皮細(xì)胞合成和釋放PDGF和bFGF，誘導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)蛋白及基質(zhì)金屬蛋白酶的產(chǎn)生，調(diào)節(jié)干擾素（IFN）γ產(chǎn)量等[7]。IL-1β的表達(dá)在感染損傷后的炎癥反應(yīng)和平滑肌細(xì)胞激活、移行、增殖的各個(gè)階段都起著很重要的作用。

細(xì)菌能夠刺激細(xì)胞產(chǎn)生促炎反應(yīng)因子IL-1β和TNF-α，并減弱吞噬細(xì)胞活性[8]。細(xì)菌脂多糖可以通過激活caspase-1誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞釋放IL-1β[9]。金黃色葡萄球菌是糖尿病感染常見致病菌，金葡溶血素α和殺白細(xì)胞素可損傷或殺死單核巨噬細(xì)胞和粒細(xì)胞。本研究顯示，高糖和金葡菌及二者交互效應(yīng)均可影響THP-1人單核細(xì)胞表達(dá)iNOS和IL-1β。高糖使iNOS和IL-1β表達(dá)減弱，細(xì)菌感染作為獨(dú)立因素可使兩指標(biāo)表達(dá)增強(qiáng)；但高糖和細(xì)菌感染同時(shí)存在時(shí)，僅IL-1β表達(dá)增強(qiáng)，iNOS表達(dá)變化不顯著，提示糖尿病感染患者免疫功能降低與高糖狀態(tài)下免疫細(xì)胞表達(dá)iNOS和IL-1β減弱有關(guān)。因此，從改善糖尿病患者細(xì)胞免疫功能的角度來講，控制患者的血糖就顯得尤為重要。同時(shí)，改善患者免疫細(xì)胞功能在一定程度上能控制和減少糖尿病感染的發(fā)生。

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