彭本英，金 敏，章 樂，許巧情

(長江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025)

育珠蚌不同組織基因組DNA提取質(zhì)量比較

彭本英，金 敏，章 樂，許巧情

(長江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025)

利用飽和酚-氯仿法分別提取了三角帆蚌(Hyriopsiscumingii)6個(gè)組織斧足、鰓、閉殼肌、性腺、肝臟、心臟中的基因組DNA，并采用紫外分光光度法、瓊脂糖凝膠電泳、PCR擴(kuò)增法分析了三角帆蚌不同組織基因組DNA的提取效果。結(jié)果表明：三角帆蚌6個(gè)組織均能成功地提取基因組DNA，但6個(gè)組織提取的DNA質(zhì)量存在差異，斧足中提取的DNA純度、濃度最高，PCR擴(kuò)增條帶最亮，因而是三角帆蚌提取DNA的最佳組織，其次為斧足和閉殼肌、心臟和性腺提取的DNA較差。

三角帆蚌(Hyriopsiscumingii)；基因組DNA；組織；提取質(zhì)量

三角帆蚌(Hyriopsiscumingii)是我國淡水珍珠養(yǎng)殖主要蚌源，養(yǎng)殖歷史悠久、產(chǎn)量高、成珠質(zhì)量好。隨著珍珠養(yǎng)殖的不斷深入，由于不規(guī)范的增養(yǎng)殖措施，如使用近源親本、苗種培育不科學(xué)、忽視養(yǎng)殖病害等[1]，使得三角帆蚌種質(zhì)退化、育珠期縮短、產(chǎn)珠質(zhì)量明顯下降。為防止三角帆蚌種質(zhì)退化，提高三角帆蚌產(chǎn)珠性能，保證淡水珍珠的品質(zhì)，利用分子生物學(xué)手段對三角帆蚌的遺傳多樣性和群體親緣關(guān)系進(jìn)行分析，為選種、育種提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)是非常必要和極其重要的。DNA提取是進(jìn)行相關(guān)研究工作的基礎(chǔ)，對三角帆蚌分子生物學(xué)研究具有重要參考價(jià)值。目前關(guān)于三角帆蚌基因組DNA已有研究[2，3]，但尚無對各個(gè)組織DNA提取效果進(jìn)行比較的報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 樣本來源及處理

2008年7月28日在湖北省荊州市江陵縣采集三角帆蚌10只，將蚌放入清水中暫養(yǎng)1周。解剖三角帆蚌，分別取斧足、心臟、鰓、閉殼肌、肝臟、性腺等6個(gè)組織，用滅菌的剪刀將各個(gè)組織剪成小塊，稱取重均為(20±2) mg的組織，用于基因組DNA的提取。分別取3只蚌的6個(gè)組織設(shè)置平行試驗(yàn)組。

1.2 樣本DNA的提取

將三角帆蚌各個(gè)組織分別置于2 mL勻漿器中，加入540 μL HB(10 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，100 mmol/L EDTA)，在冰上將各個(gè)組織充分勻碎后，將所有液體吸入2 mL EP管中，加入60 μL 10% 十二烷基磺酸鈉和20 μL 10 mg/mL的蛋白酶K，于55 ℃水浴鍋中消化至裂解液變澄清。

裂解液分別用等體積的酚∶ 氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)抽提2次，加入2倍體積的無水乙醇離心沉淀DNA，用70%的乙醇清洗2次后置于濾紙上晾干，加入50 μL TE緩沖液(pH 8.0)，4 ℃冰箱放置過夜，讓DNA充分溶解。

1.3 DNA純度、濃度及得率的計(jì)算

取適量DNA稀釋后，以TE為對照，在德國Eppendorf分光光度儀(BioPhotometer)上測定其在260 nm、280 nm和230 nm波長處的光密度。DNA的純度可以從D260/D280比值來判斷。按下述公式分別計(jì)算DNA濃度和得率：DNA濃度(μg/μL)=D260×n(稀釋倍數(shù))×50 (μg/mL)÷1 000；得率(μg/g)=DNA量(μg)/樣品量(g)。

1.4 DNA的PCR擴(kuò)增

選用三角帆蚌的看家基因β-actin對所提取的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測DNA提取效果。PCR反應(yīng)條件為：94 °C預(yù)變性5 min后；按照94 °C變性30 s，56 °C退火30 s，72 °C延伸1.0 min的循環(huán)參數(shù)運(yùn)行25個(gè)循環(huán)；最后72 °C延伸10 min終止反應(yīng)。反應(yīng)體積20 μL，組成如下：5 ng DNA模板，10 μmol引物各1 μL，2.5 mmol/L dNTP 2 μL，10×buffer 2.5 μL，Blend Taq酶 (Fermentas公司) 0.25 μL，補(bǔ)足H2O 至20 μL。PCR產(chǎn)物在含溴化乙錠的1.5%瓊脂糖凝膠中電泳分離。用凝膠成像系統(tǒng)(White/Ultraviolet Transilluminator GDS8000型，UVP公司)記錄擴(kuò)增產(chǎn)物條帶。

三角帆蚌β-actin引物為武漢博杰公司合成，序列為：F/R： CCGTGTTTCCATCCATCGT/CAGGACTGGGTGCTCTTCA。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Statistica統(tǒng)計(jì)軟件中Duncan’s多重比較進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 三角帆蚌不同組織DNA提取電泳結(jié)果

1:λ DNA Hind Ⅲ/Kpn Ⅰ 雙酶切(bp)；2～4:斧足；5～7:鰓；8～10:閉殼?。?1～13:性腺；14～16:肝臟；17～19:心臟圖1 三角帆蚌不同組織DNA提取效果電泳圖Figure 1 DNA Electrophoresis in different tissues of Hyriopsis cumingii

三角帆蚌斧足、鰓、閉殼肌、性腺、肝臟和心臟等6個(gè)組織均能提取較高質(zhì)量的DNA，其中以斧足的提取效果最好，基因組DNA很完整，無拖尾現(xiàn)象，且濃度較高。性腺組織提取的DNA也無拖尾現(xiàn)象，但DNA的亮度較低。鰓、閉殼肌、肝臟和心臟等4個(gè)組織提取的DNA均有拖尾現(xiàn)象出現(xiàn)(圖1)。

2.2 不同組織DNA純度和得率比較

三角帆蚌6個(gè)組織提取的基因組DNA的純度均較高，6個(gè)組織所測DNA的D260/D280值均在1.8～2.0之間。但不同的組織提取的基因組DNA濃度存在明顯地差異，其中肝臟、心臟、斧足和閉殼肌等4個(gè)組織提取的DNA濃度較高，鰓和性腺中DNA濃度較低(表1)。

表1 三角帆蚌不同組織基因組DNA 純度和得率比較Table 1 Extraction DNA purity and extraction rate in different tissues of Hyriopsis cumingii

注：同行不同小寫字母表示組織間差異顯著(Plt;0.05)。

1:斧足；2:性腺；3:心臟；4:肝臟；5:鰓；6:閉殼肌；7:DL 2000 Marker圖2 三角帆蚌不同組織基因組DNA PCR擴(kuò)增效果比較Figure 2 PCR amplification comparison in DNA extractraion from different tissues of Hyriopsis cumingii

2.3 不同組織DNA的PCR擴(kuò)增效果比較

將三角帆蚌不同組織所提取的DNA稀釋為10 ng/μL作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，每個(gè)反應(yīng)取模板量為0.5 μL。利用三角帆蚌看家基因β-actin對所有組織所提取的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示如圖2。β-actin目的片段為227 bp。在所有6個(gè)組織中均能檢測到β-actin的目的條帶，但肝臟和斧足中條帶最亮，其次為閉殼肌，鰓、性腺和心臟的條帶較弱。

3 討論

生物體組織細(xì)胞中的脫氧核糖核酸(DNA)部分與蛋白質(zhì)結(jié)合，以核蛋白-脫氧核糖核蛋白(DNP)的形式存在。平衡酚-氯仿法是利用SDS裂解細(xì)胞，蛋白酶K消化大部分蛋白質(zhì)，最后用酚+氯仿+異戊醇除去剩余的蛋白質(zhì)。如果提取的DNA中含有蛋白質(zhì)污染會影響后續(xù)的試驗(yàn)，因而采用酚+氯仿+異戊醇2次抽提的方法盡可能將其中的蛋白質(zhì)除去干凈。此外，考慮到軟體動物斧足內(nèi)部結(jié)構(gòu)堅(jiān)硬，蛋白質(zhì)含量高[4]，因而相對于劉瑾等[3]所描述的提取三角帆蚌基因組DNA的4種方法(苯酚法、改進(jìn)苯酚法、CTAB法和改進(jìn)ROSE法)來說，本研究采用的平衡酚-氯仿法增加1倍的蛋白酶K的加入量，電泳結(jié)果以及分光光度計(jì)測定的D260/D280結(jié)果表明，這種方法達(dá)到了較好的效果，各個(gè)組織所提取的DNA中基本無蛋白污染。此外，本研究不需要液氮，方便于一般的實(shí)驗(yàn)室操作。

目前在利用軟體動物雙殼類提取基因組DNA時(shí)，最常選擇的組織是肌肉。如包永波等[4]用西施舌的斧足提取基因組DNA；劉瑾等[3]用三角帆蚌的斧足提取DNA；於瓊維等[2]用褶紋冠蚌的閉殼肌提取DNA。一方面是由于這2個(gè)組織取樣很容易，另一方面，本研究中三角帆蚌6個(gè)組織基因組DNA的提取效果比較顯示，斧足DNA的電泳圖譜完整、無拖尾現(xiàn)象、DNA純度和濃度高、PCR擴(kuò)增條帶亮。因而三角帆蚌提取基因組DNA的最佳組織為斧足。雖然三角帆蚌閉殼肌提取的DNA純度和濃度均較高，但電泳圖譜中有少量拖尾現(xiàn)象，且PCR擴(kuò)增條帶也不是很亮，因而閉殼肌不是三角帆蚌提取DNA最適材料。肝臟是脊椎動物常用的提取基因組DNA材料[5，6]，軟體動物是無脊椎動物中唯一具有肝臟的動物。利用三角帆蚌肝臟提取基因組DNA雖然電泳顯示有少許的拖尾，但分光光度計(jì)測定的結(jié)果表明其純度和濃度均較高，PCR擴(kuò)增的條帶也很亮。三角帆蚌的肝臟是位于膨大的胃周圍、褐色的消化腺。由于貝類的斧足和閉殼肌在勻漿的過程中很難完全勻碎，相對來說肝臟的勻漿就容易得多，因而肝臟也非常適合作為三角帆蚌提取DNA的材料。而三角帆蚌性腺和心臟無論是從電泳圖譜、純度、濃度還是PCR擴(kuò)增來看提取的DNA均不是很好，而且非專業(yè)人員不能夠正確地判斷2種組織并對其取樣，因而不建議利用這2種組織來提取DNA。

對于從基因組DNA上擴(kuò)增大片段基因(例如gt;10 kb的基因)的實(shí)驗(yàn)來說，要求提取的DNA盡可能完整、斷裂少、大部分DNA保持長的雙鏈。因而在提取基因組DNA抽提的過程中搖蕩液體動作要輕緩，轉(zhuǎn)移液體的過程中吸樣及放樣動作要緩慢，且盡可能采用剪頭滅菌的槍頭。

[1]溪 流. 我國淡水珍珠業(yè)面臨的問題 [J]. 現(xiàn)代漁業(yè)信息，2006，21(9):36.

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2010-01-12

湖北省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2008CDB104);湖北省教育廳資助項(xiàng)目(Q20081204)

彭本英(1968-)，女，湖北荊州人，助理實(shí)驗(yàn)師，研究方向?yàn)閯游锓肿用庖邔W(xué).

許巧情，E-mail:xuqiaoqing@163.com

10.3969/j.issn.1673-1409(S).2010.02.014

Q75;Q959.215

A

1673-1409(2010)02-S041-03