李金良,李旭廷,聶 建,龔 雪,袁定勝,詹素瓊,鄒立扣

(1.四川省畜牧科學(xué)研究院,四川 成都 610066;2.四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,四川 成都 610064)

細(xì)菌性疾病一直以來是規(guī)?；i場疾病防控的重點,歷年的調(diào)查表明,直接或繼發(fā)細(xì)菌感染是臨床發(fā)病和死亡的主要原因,造成的損失巨大。目前對規(guī)?；i場單一疾病的調(diào)查研究較多,對較全面的病原菌檢測和耐藥性研究較少。為了更全面地掌握西南地區(qū)規(guī)?；i場病原菌流行情況和耐藥情況,實驗室對2008～2009年間西南地區(qū)的病樣進(jìn)行了病原菌的分離鑒定、致病性試驗和藥敏試驗,報告如下。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 TSA瓊脂,TSB肉湯,麥康凱瓊脂,S.S.瓊脂,MH瓊脂,NAD,酵母浸膏購自廣州環(huán)凱微生物科技有限公司;藥敏紙片購自廣州迪景微生物科技有限公司,PCR引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成;GoldView染料、瓊脂糖、DNA Marker 2 000購自成都飛克(天泰)生物科技有限公司。

1.2 儀器 OLYMPUS顯微鏡,隔水式恒溫培養(yǎng)箱,PCR儀(Bio-Rad),DYY-Ⅱ恒壓恒流電泳儀(Bio-Rad),Gene凝膠成像儀。

1.3 細(xì)菌分離純化 病料樣本來源為剛死亡病豬、瀕死豬和已解剖取樣后的臟器組織,取樣部位為心、心包積液、胸腔積液、肺、肝、脾、腎、淋巴結(jié)、膽囊、十二指腸等。用無菌棉拭子蘸取組織液,接TSA血平板、巧克力瓊脂(含NAD和酵母浸膏)、麥康凱和S.S.瓊脂,37℃培養(yǎng),菌落生長后著重選優(yōu)勢菌落,進(jìn)行1～2次劃線純化細(xì)菌。

1.4 細(xì)菌鑒定

1.4.1 菌落形態(tài)特征觀察 對大小、形狀、顏色、光滑粗糙與否、擴散與否,溶血與否等基本性狀進(jìn)行區(qū)分,并單獨劃線純化,革蘭染色后顯微鏡觀察。

1.4.2 16S rDNA序列分析 試驗采取菌落PCR法擴增細(xì)菌16S rDNA基因,引物為16SrDNA通用引物 27F(5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′)、1492R(5′-TACGGHTACCTTACGACTT-3′)。反應(yīng)條件：95℃5 min;95℃1 min,50℃1 min,72℃1.5 min,30次循環(huán);72℃延伸 5 min;4℃保存。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。獲取1 400 bp左右的目標(biāo)片段后,PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司純化并測序,利用BLAST搜索軟件將菌株16S rDNA序列結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫比對后鑒定細(xì)菌。

1.5 致病性試驗 將純化菌落用生理鹽水稀釋至5.0×108CFU/mL,0.5 mL腹腔注射小鼠,觀察3 d,剖檢死亡小鼠,取心血、肝臟劃線培養(yǎng),革蘭染色觀察,并與初始培養(yǎng)細(xì)菌信息對照,確定菌株致病性。

1.6 藥敏試驗 試驗重點選取致病菌株和具有地方代表性的典型菌株進(jìn)行藥敏試驗,按照CLSI推薦的K-B法進(jìn)行。根據(jù)NCCLS(2006)的標(biāo)準(zhǔn)判定其耐藥性。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌檢驗和致病性結(jié)果 本實驗室在2008年到2009年間對西南地區(qū)47個大、中、小型規(guī)?；i場364份病樣進(jìn)行細(xì)菌分離,307份病樣檢出病原菌,分離率達(dá)84.3%,其中115份病樣檢測出1種以上細(xì)菌,混合感染率為37.4%。試驗共分到病原菌509株,病原菌檢出分布和致病性試驗結(jié)果見表1。

表1 病原菌檢出分布和致病性試驗結(jié)果

檢出病原菌主要有大腸桿菌、葡萄球菌、腸球菌、肺炎克雷伯菌、變形桿菌、鏈球菌(表1)。其中革蘭陰性菌中有134株有致病性;革蘭陽性菌有56株有致病性,革蘭陰性菌(46.8%)的致病率明顯高于革蘭陽性菌(25.1%)。

大腸桿菌多分離自心、脾臟、腎臟和淋巴結(jié),占30.4%,小鼠致死率高達(dá) 56.4%。葡萄球菌占21.6%,主要有豬葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、松鼠葡萄球菌、產(chǎn)色葡萄球菌、腐生葡萄球菌、緩慢葡萄球菌、表皮葡萄球菌,致死率較低(19%)。鏈球菌主要為豬鏈球菌和豬肺炎鏈球菌(5.9%),致死率高達(dá)66.6%。腸球菌有糞腸球菌和屎腸球菌,占11.4%,致死率低(10.3%)。肺炎克雷伯菌(8.7%)檢出率和致死率(31.8%)都較高。變形桿菌主要是奇異變形桿菌(8.5%),致死率16.2%。志賀氏菌、沙門菌、巴氏桿菌、嗜血桿菌、放線桿菌檢出率較低(＜4%),但致死率較高(＞36%)。其他檢出細(xì)菌占2.3%,有檸檬酸細(xì)菌、羅斯氏菌、產(chǎn)酸克雷菌、洛菲不動桿菌、惡臭假單胞菌、產(chǎn)氣單胞菌、綠淺氣球菌,致死率高(41.6%)。

2.2 菌株耐藥性研究結(jié)果 本研究選取了191株致病菌株為主的病原菌,進(jìn)行了7類共17種藥物的藥敏試驗,結(jié)果如下。

2.2.1 病原細(xì)菌耐藥率結(jié)果與分析 見表2。

表2 病原菌耐藥率

根據(jù)耐藥率的結(jié)果發(fā)現(xiàn),整體上,不同種屬的細(xì)菌的耐藥情況有少數(shù)差異,但基本一致,革蘭陰性菌以大腸桿菌為代表,革蘭陽性菌以葡萄球菌為代表。

按藥物不同比較,復(fù)合β-內(nèi)酰胺酶抑制劑類藥物(AMC,SAM,TIM)和頭孢噻呋(EFT)的整體耐藥率都較低(≤18.8%),其他13種藥物耐藥性高,其中氨芐西林(AMP),阿莫西林(AML),替卡西林(TIC),紅霉素(E),克林霉素(DA),林可霉素(MY),土霉素(OT)的耐藥最為嚴(yán)重(革蘭陰性菌70.5%～96.4%,革蘭陽性菌42.4%～92.4%)。

革蘭陰性的3類細(xì)菌(大腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌、變形桿菌)耐藥情況相當(dāng);不同點：大腸桿菌對頭孢類藥物(EFT,KF,CL)耐藥率明顯高于其他兩類革蘭陰性菌;變形桿菌對慶大霉素(CN)、諾氟沙星(NOR)、環(huán)丙沙星(CIP)的耐藥率(83.3%)高于其他兩種革蘭陰性菌(≤69.2%),但對丁胺卡那霉素(KAN)、頭孢類藥物(EFT,KF,CL)較敏感(16.6%)。

革蘭陽性的3類細(xì)菌(葡萄球菌、鏈球菌、腸球菌)相比較,耐藥情況基本一致;不同點：腸球菌對頭孢噻吩(KF)的耐藥率(15.7%)明顯低于其他兩類革蘭陽性菌(≥40.8%),對林可霉素(MY)的耐藥率高達(dá)100%;葡萄球菌對丁胺卡那霉素(KAN)的耐藥率(30.6%)低于其他兩類革蘭陽性菌(≥52.6%)。

2.2.2 菌株耐藥的多重性分析 見表3。

菌株多重耐藥性以 4重、5重、6重耐藥(16.2%,26.1%,28.8%)為主,3重和 7重耐藥(9.9%)其次,只耐一類藥和2重耐藥的菌株很少(2%,5.7%)。

研究表明,7類抗生素都存在耐藥菌株分布數(shù)目隨“多重指數(shù)”增加而增加的現(xiàn)象,但由于菌株對復(fù)合β-內(nèi)酰胺酶抑制劑類藥物較敏感,造成7重的耐藥菌株數(shù)較少,而不是隨趨勢攀升。

菌株在這7類抗生素上的構(gòu)成比反映了對7類抗生素的總耐藥率,和表2中單藥的耐藥率比較發(fā)現(xiàn)：復(fù)合 β-內(nèi)酰胺酶抑制劑類藥物總耐藥率(23.5%)遠(yuǎn)高于(2倍以上)對應(yīng)3種(AMC,SAM,TIM)中任意一個的耐藥率(9.4%～11.3%),說明菌株對該類的3種藥物的“耐藥譜離散度”較大,同時耐2種和3種復(fù)合β-內(nèi)酰胺酶抑制劑類藥物的細(xì)菌很少。其他6類抗生素總耐藥率略高于單藥的耐藥率,但差值不大,說明菌株對同類藥物之間交叉耐藥的情況居多。

表4 菌株對7類抗生素的多重耐藥結(jié)果表

3 討論

3.1 病原菌流行特點 本實驗室在2008～2009年間臨床研究發(fā)現(xiàn),西南地區(qū)規(guī)?；i場(患豬)細(xì)菌檢出率很高(84.3%),病原菌的分布與豫北地區(qū)和浙江地區(qū)的類似報道有所不同,與上海地區(qū)2007年報道相當(dāng)[1-3],其中大腸桿菌、鏈球菌檢出率基本一致,大腸桿菌仍然是規(guī)?；i場主要檢出病原,并且致病性在其他報道中也很高(＞70%)[4-6],所以控制大腸桿菌病仍然是豬場疾病防控的重點。肺炎克雷伯氏菌、腸球菌、葡萄球菌、變形桿菌檢出率都比其他報道高,特別是肺炎克雷伯氏菌、腸球菌在豬場的研究中少有報道,而人醫(yī)上研究報道較多[7],值得關(guān)注。

3.2 耐藥性流行情況 耐藥性的研究顯示,頭孢類藥物和獸醫(yī)上應(yīng)用相對較少的復(fù)合β-內(nèi)酰胺酶抑制劑類藥物的耐藥率低,而以前廣泛使用的藥物耐藥率都很高,與其他地區(qū)豬場和人醫(yī)報道情況相當(dāng)[8-9]。本次結(jié)果與四川大學(xué)田國寶(2003～2005)和湯景元(2006～2007)研究結(jié)果相比發(fā)生變化,一致的是西南地區(qū)病原菌對頭孢類耐藥性較低,青霉素類、大環(huán)內(nèi)酯類和四環(huán)素類耐藥率仍然非常高,不同的是以往報道有一定敏感性的氨基糖苷類藥物(CN、KAN)耐藥率已經(jīng)逐漸升高(2005年10%左右到目前 45%左右),氟奎諾酮類藥物(NOR、CIP)耐藥率從 2003年的 38.9%上升到目前60%左右[10-11],上升趨勢令人擔(dān)憂;病原菌多重耐藥以5重、6重耐藥為普遍趨勢,這與目前豬場用藥不合理,不規(guī)范和飼料添加抗生素等濫用情況有關(guān)。本研究還將對耐藥基因的流行情況進(jìn)一步研究。

3.3 規(guī)?；i場細(xì)菌性疾病探討 細(xì)菌疾病的發(fā)生不是偶然的,原因很多,但主要有兩點需要重視：第一,病毒性疾病的流行得不到有效控制,特別是豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒對豬免疫系統(tǒng)的破壞加大了細(xì)菌感染幾率和造成病發(fā)死亡率升高。第二,豬場管理和生產(chǎn)細(xì)節(jié)存在漏洞,給細(xì)菌很大的傳播和繁殖的空間,加大發(fā)病的可能,特別是濫用抗菌藥物導(dǎo)致正常菌群失衡誘發(fā)條件致病菌發(fā)病等情況需要引起高度重視。在對疾病治療前應(yīng)做好檢測,針對性用藥。杜絕盲目用藥造成耐藥性加劇,最后導(dǎo)致無藥可用的局面,對疾病的防控理念應(yīng)在優(yōu)化日常管理和加強衛(wèi)生消毒中,減少日常投藥。

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