涂 佳， 鄧學(xué)良， 李忠海， 薛敏敏

(中南林業(yè)科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院， 湖南 長(zhǎng)沙 410004)

響應(yīng)面法優(yōu)化野生毛葡萄中原花青素醇提工藝的試驗(yàn)

涂 佳， 鄧學(xué)良， 李忠海， 薛敏敏

(中南林業(yè)科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院， 湖南 長(zhǎng)沙 410004)

依據(jù)響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)法，選取乙醇濃度(A)、料液比(B)、反應(yīng)溫度(C)為考察因素，對(duì)野生毛葡萄籽中原花青素醇提工藝進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)。經(jīng)對(duì)各因素的顯著性和交互作用的分析，得出野生毛葡萄籽中原花青素醇提的最佳工藝條件為： 乙醇濃度為64%、料液比為1∶7、提取溫度為35℃。建立的原花青素醇提數(shù)學(xué)模型為：Y=0.61-0.058A+0.029B-0.12C+0.025AC-0.013BC-0.091A2-0.095B2-0.17C2，原花青素得率的預(yù)測(cè)值為86.95mg·g-1、驗(yàn)證值為85.54mg·g-1。證明此模型是合理可靠的，可用于實(shí)際預(yù)測(cè)。

野生毛葡萄籽； 原花青素； 醇提； 響應(yīng)面法； 優(yōu)化

野生毛葡萄(VitisquinquangularisRehd.)是葡萄科(Vitaceae)葡萄屬(VitisL)真葡萄亞屬(E-uvitis)東亞種群中的一個(gè)種,是我國(guó)葡萄屬東亞種群中分布最廣的一個(gè)野生種,生長(zhǎng)在山區(qū)林緣和灌木叢中,主要分布于秦嶺、泰山以南17個(gè)省份的廣大地區(qū)。野生葡萄分布范圍廣，資源儲(chǔ)量大，因而促進(jìn)湖南地區(qū)的野生葡萄資源開(kāi)發(fā)利用與產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)有重要意義。原花青素(Proanthocynadiin，簡(jiǎn)稱(chēng)PC)是存在于葡萄中的一種天然植物多酚[1],在葡萄皮、籽中含量很豐富。目前已報(bào)道的不同原料中原花青素的提取方法主要有溶劑法及儀器輔助提取法。本試驗(yàn)采用溶劑提取法，常用的提取溶劑包括熱水、甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯及其水溶液等?？紤]到食用安全性，本試驗(yàn)用乙醇作為提取溶劑，并采用響應(yīng)面分析法對(duì)影響原花青素醇提的關(guān)鍵因素進(jìn)行優(yōu)化，以期為科學(xué)利用野生毛葡萄籽中的原花青素提供參考。

1 儀器及材料

1.1主要儀器

紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(UV — 1700)，日本島津公司；操作軟件(UV — PROBE)，日本島津公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(R201D — Ⅱ)，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；真空冷凍干燥儀 (FD — IA)，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.2主要試劑及配置

原花青素(含量>95%)，天津尖峰天然產(chǎn)物研究開(kāi)發(fā)有限公司；乙醇，國(guó)產(chǎn)工業(yè)級(jí)，其它試劑為分析純。

2 試驗(yàn)方法

2.1樣品處理

將完整野生毛葡萄鮮果洗凈，手工剝皮，取籽。毛葡萄籽洗凈晾干后研磨，過(guò)40目篩，立即置入30℃石油醚中脫脂8h，晾干，冷凍保存?zhèn)溆茫幻咸哑そ?jīng)真空冷凍干燥后研磨，立即置入30℃石油醚中脫脂8h，晾干，冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2原花青素測(cè)定原理

原花青素和兒茶素類(lèi)單體的A環(huán)的化學(xué)活性較高,在酸性條件下,其上的間苯二酚或間苯三酚與香草醛發(fā)生縮和,產(chǎn)物在濃酸作用下形成紅色的正碳離子,樣品的濃度與產(chǎn)生的顏色呈正相關(guān), 500nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸收光值[2]。利用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在較大穩(wěn)定吸收波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值，對(duì)照原花青素曲線，測(cè)得原花青素的含量。

2.3檢測(cè)條件及波長(zhǎng)的確定

將制備好的原花青素提取液0.5mL與2.5mL 30g·L-1香草醛和2.5mL 30%硫酸于30℃避光反應(yīng)15min后，利用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在200～800nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，確定測(cè)定原花青素的檢測(cè)波長(zhǎng)。原花青素與香草醛的酚醛縮合反應(yīng)生成的紅色物質(zhì)在500nm波長(zhǎng)處有最大吸收，據(jù)此，試驗(yàn)中采用分光光度法于在500nm處測(cè)定原花青素含量[3]。

2.4原花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱(chēng)量預(yù)先烘干的原花青素0.05g，用甲醇溶解，并用甲醇定溶至50mL，得到濃度為 1g·L-1的原花青素標(biāo)準(zhǔn)溶液。將上述標(biāo)準(zhǔn)溶液分別配制成濃度為 0.01mg·mL-1、0.05mg·mL-1、0.1mg·mL-1、0.15mg·mL-1、0.2mg·mL-1、0.25mg·mL-1、0.3mg·mL-1、0.35mg·mL-1、0.4mg·mL-1的原花青素標(biāo)準(zhǔn)溶液。于試管中依次加入0.5mL不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)水溶液、2.5mL 30g·L-1香草醛的甲醇溶液及2.5mL 30%H2SO4的甲醇溶液，混勻后于30℃水浴保溫20min后測(cè)定A500nm，繪制原花青素的標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光值，可以求出原花青素濃度與其吸光值的數(shù)學(xué)關(guān)系。用spss軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，所得到的回歸方程為A=2.08C-0.016(C:濃度mg·mL-1；A:吸光值；相關(guān)系數(shù):r=0.998)。結(jié)果表明原花青素含量在0.010～0.400mg·mL-1范圍內(nèi)與吸光值線性關(guān)系良好。

2.5原花青素提取工藝優(yōu)化

2.5.1 原花青素提取單因素試驗(yàn)

(1) 最佳提取劑的選擇。稱(chēng)取1g 40目脫脂葡萄籽，按1∶7的料液比，在50%、70%、90%的乙醇中于40℃提取40min(2次)后離心過(guò)濾，用相對(duì)應(yīng)的浸提劑定容至25mL，取0.5mL加入2.5mL 30g·L-1香草醛的甲醇溶液及2.5mL 30%H2SO4的甲醇溶液，混勻后于30℃水浴保溫20min后，利用紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)在500nm處測(cè)其吸光度。

(2) 料液比對(duì)原花青素提取效果的影響。稱(chēng)取1g 40目脫脂葡萄籽，按料液比為1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9的比例加入70%乙醇浸提劑于40℃提取40min(2次)后離心過(guò)濾，用相對(duì)應(yīng)的浸提劑定容至25mL，取0.5mL加入2.5mL 30g·L-1香草醛的甲醇溶液及2.5mL 30%H2SO4的甲醇溶液，混勻后于30℃水浴保溫20min后，利用紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)在500nm處測(cè)其吸光度。

(3)溫度對(duì)原花青素提取效果的影響。稱(chēng)取1g 40目脫脂葡萄籽，按1∶7的料液比加入70%乙醇浸提劑，分別于20℃、30℃、40℃、50℃提取40min(2次)后離心過(guò)濾，用相對(duì)應(yīng)的浸提劑定容至25mL，取0.5mL加入2.5mL 30g·L-1香草醛的甲醇溶液及2.5mL 30%H2SO4的甲醇溶液，混勻后于30℃水浴保溫20min后，利用紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)在500nm處測(cè)其吸光度。

(4)提取時(shí)間對(duì)原花青素提取效果的影響。稱(chēng)取1g 40目脫脂葡萄籽，按1∶7的料液比加入70%乙醇浸提劑，于40℃分別提取20min、40min、60min、80min(2次)后離心過(guò)濾，用相對(duì)應(yīng)的浸提劑定容至25mL，取0.5mL加入2.5mL 30g·L-1香草醛的甲醇溶液及2.5mL 30%H2SO4的甲醇溶液，混勻后于30℃水浴保溫20min,后利用紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)在500nm處測(cè)其吸光度。

2.5.2 原花青素提取率的計(jì)算

2.5.3 響應(yīng)面優(yōu)化原花青素提取方法 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，篩選出影響原花青素提取效果的因素：溶液濃度、料液比、反應(yīng)溫度。以不同提取濃度A、不同料液比B和不同的提取溫度C3因素3水平，以+1、0、-1分別代表自變量的高、中、低水平，按方程xi=(Xi-X0)X0/ΔX對(duì)自變量進(jìn)行編碼，共設(shè)立了20個(gè)處理組。其中，xi為自變量的編碼值，Xi為自變量的真實(shí)值，X0為試驗(yàn)中心點(diǎn)處自變量的真實(shí)值，ΔX為自變量的變化步長(zhǎng)，因子編碼及水平見(jiàn)表1，響應(yīng)設(shè)計(jì)見(jiàn)表2。

表1 原花青素提取因素水平表水平(xi)浸提液濃度(A)(%)料液比(B)(固∶液)提取溫度(C)(℃)1501∶6302701∶7403901∶850注:x1=(A-70)/20;x2=(B-6)/2;x3=(C-40)/10

2.5.4 葡萄皮原花青素與葡萄籽原花青素的比較 利用葡萄籽最優(yōu)提取條件，提取葡萄皮中原花青素，比較兩者原花青素含量。

3 結(jié)果與分析

3.1乙醇濃度對(duì)原花青素提取效果的影響

從圖1可以看出，在70%乙醇中原花青素提取率最高。

圖1 乙醇濃度對(duì)原花青素提取率的影響

3.2料液比對(duì)原花青素提取效果的影響

以70%乙醇為提取劑。不同的料液比對(duì)原花青素提取效果的影響見(jiàn)圖2。提取效果隨料液比增大而增大，當(dāng)料液比達(dá)到一定程度時(shí)，再增大料液比提取效果基本穩(wěn)定，但若料液比增大到一定值后再繼續(xù)增大，提取率反而降低。說(shuō)明適宜的料液比能達(dá)到最好的提取效果，這時(shí)有效成分基本溶出，沒(méi)必要再增大料液比。由圖2可知，最適料液比為1∶7。

圖2 不同料液比對(duì)原花青素提取率的影響

3.3提取溫度對(duì)原花青素提取效果的影響

不同的提取溫度對(duì)原花青素提取效果的影響見(jiàn)圖3。由圖3可知，提取溫度在20～50℃之間時(shí)，提取物中原花青素含量隨溫度的增加而迅速增加，在50℃時(shí)開(kāi)始下降。當(dāng)溫度大于50℃時(shí)，提取物中原花青素會(huì)分解。因此，為了盡量減小有用成分的損失，提高產(chǎn)品活性成分的含量，降低生產(chǎn)成本，宜選擇提取溫度為40℃較適合。

圖3 不同提取溫度對(duì)原花青素提取率的影響

3.4提取時(shí)間對(duì)原花青素提取效果的影響

不同提取時(shí)間對(duì)原花青素提取效果的影響見(jiàn)圖4。由圖4可知，提取時(shí)間在40min內(nèi)，提取物中原花青素的含量隨時(shí)間的延長(zhǎng)明顯增加，但40min之后，原花青素含量不再增加。這可能是由于在一定范圍內(nèi)，提取時(shí)間越長(zhǎng)，提取液與被提取物質(zhì)相互作用的時(shí)間越長(zhǎng)，因而提取率就越高，但當(dāng)兩者達(dá)到平衡后，提取率將不再增加，如果再延長(zhǎng)提取時(shí)間其它雜質(zhì)也可能被提取出來(lái)，從而可能使產(chǎn)品的有效成分含量相對(duì)減少，因此提取時(shí)間應(yīng)控制在40min左右。

圖4 不同提取時(shí)間對(duì)原花青素提取率的影響

3.5響應(yīng)面優(yōu)化法提取原花青素

3.5.1 響應(yīng)面法優(yōu)化原花青素提取條件 以乙醇濃度、料液比、反應(yīng)溫度為自變量。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果并綜合考慮生產(chǎn)工藝易行性，固定提取溫度為40℃，用響應(yīng)面法，以紫外吸光度值為響應(yīng)值(因變量Y)，對(duì)乙醇濃度(A)、料液比(B)和反應(yīng)溫度(C)3因素的3水平進(jìn)行原花青素提取條件優(yōu)化,試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2。

如表2所示，試驗(yàn)點(diǎn)共有20個(gè)。可分為2類(lèi)：即14個(gè)析因點(diǎn)和零點(diǎn)，零點(diǎn)為區(qū)域的中心點(diǎn)。零點(diǎn)試驗(yàn)重復(fù)6次，以估計(jì)誤差。按照Design Expert軟件中的Central Composite Design模型，對(duì)試驗(yàn)獲得的原花青素得率響應(yīng)值進(jìn)行回歸，建立二次回歸模型。初步回歸方程為：

Y= 0.61-0.058A+0.029B-0.12C+0.025AC-

0.013BC-0.091A2-0.095B2-0.17C2

3.5.2 回歸分析 利用Design Expert7.1 軟件進(jìn)行二次多元回歸擬合，由軟件失擬項(xiàng)測(cè)試推薦的二次模型擬合試驗(yàn)數(shù)據(jù)，采用二次模型進(jìn)行變異分析(Analysis of variance，ANOVA)。表3中，模型P項(xiàng)<0.0001，表明吸光度值高度顯著；相關(guān)系數(shù)R2為0.9978，表明模型擬合度較好；離散系數(shù)為2.85，表明模型的精度高，適用性好；A、B、C、AB、BC、AC、A2、B2、C2的P值均在0.05 以下，說(shuō)明乙醇濃度、料液比、反應(yīng)溫度的交互作用對(duì)吸光度值有顯著影響。模型的P失擬為0.1565 不顯著，說(shuō)明模型可靠，可以用于原花青素的測(cè)定。依據(jù)系數(shù)估計(jì)值A(chǔ)=-0.058、B=0.029、C=-0.12可知，因素的主次效應(yīng)關(guān)系為乙醇濃度>料液比>浸提溫度。

表2 響應(yīng)面法設(shè)計(jì)試驗(yàn)組號(hào)浸提液濃度(A)(%)料液比(B)(固∶液)提取溫度(C)(℃)吸光度值x1x2x31-1-1-10.4321-1-10.233-11-10.48411-10.355-1-110.1561-110.087-1110.1881110.129-1000.57101000.45110-100.48120100.531300-10.56140010.3150000.619160000.613170000.605180000.62190000.597200000.43

在α=0.05顯著水平下剔除不顯著項(xiàng)后，對(duì)方程進(jìn)行優(yōu)化可得：

Y= 0.61-0.058A+0.029B-0.12C+0.025AC-

0.013BC-0.091A2-0.095B2-0.17C2

根據(jù)回歸分析結(jié)果，作出模型響應(yīng)面和等高線圖，如圖5～7所示。

由圖5可以看出，在料液比較少時(shí)，隨著乙醇濃度的增大，原花青素提取率先增大到濃度70%后逐漸減??；料液比增加后，當(dāng)乙醇濃度增大到70%左右時(shí)，總提取率達(dá)到最大，再增大乙醇濃度，提取率反而下降，這與單因素試驗(yàn)結(jié)果相符。從圖6可以看出，在提取溫度較低時(shí)，隨著乙醇濃度的增大，原花青素提取率先增大后減??；溫度增高后，當(dāng)乙醇濃度增大到62%～65%時(shí)，總提取率達(dá)到最大，再增大乙醇濃度，提取率反而下降，這與單因素試驗(yàn)結(jié)果相符，分析原因可能是在高溫高濃度乙醇條件下，葡萄液中一些醇溶性雜質(zhì)溶解量增大，這些物質(zhì)與原花青素競(jìng)爭(zhēng)同乙醇 — 水分子的結(jié)合，從而導(dǎo)致原花青素提取率降低。從圖7可以看出，在反應(yīng)溫度低時(shí)，提取率隨著料液比先增加后減少；但當(dāng)反應(yīng)溫度達(dá)到一定程度時(shí)(40℃左右時(shí))料液比在1∶7左右提取效果最好，再增大料液比提取效果反而下降。

表3 模型與方差分析來(lái)源平方和自由度均方F值P-值顯著性模型0.6710.075498.86<0.0001顯著A—浸提液濃度0.03410.034224.76<0.0001B—料液比8.410E—0.0318.410E—00356.19<0.0001C—溫度0.1510.15994.45<0.0001AB8.000E—00418.000E—0045.530.0434AC5.000E—00315.000E—00333.410.0002BC1.250E—00311.25E—0038.350.0161A20.02310.023150.49<0.0001B20.02510.025167.57<0.0001C20.0810.080534.13<0.0001殘差1.497E—0.03101.498E—004失擬項(xiàng)1.084E—00352.168E—0042.630.1565不顯著純誤差4.128E—00453.577E—003 復(fù)相關(guān)系數(shù)R2=0.9978離散系數(shù)為2.85

圖5 乙醇濃度和料液比對(duì)原花青素提取的影響

圖6 乙醇濃度和反應(yīng)溫度對(duì)原花青素提取的影響圖

圖7 料液比和反應(yīng)溫度對(duì)原花青素提取的影響

進(jìn)一步用Design Expert軟件對(duì)試驗(yàn)?zāi)Ｐ瓦M(jìn)行典型性分析，以獲得最優(yōu)的提取條件。經(jīng)分析得，在A=64、B=7、C=35，即在乙醇濃度為64%、料液比為1∶7、提取溫度為35℃時(shí)得到理論最大值(A500nm)為0.641。

3.5.3 驗(yàn)證試驗(yàn) 為了驗(yàn)證響應(yīng)面法的可行性，采用得到的最佳提取條件進(jìn)行野生毛葡萄籽原花青素提取試驗(yàn)，乙醇濃度64%、料液比1∶7、溫度35℃。3次平行試驗(yàn)得到的實(shí)際平均值(A500nm)為0.631，與方程模擬值相吻合。在此條件下，野生毛葡萄籽原花青素的提取率為85.54mg·g-1。因此響應(yīng)面法對(duì)野生毛葡萄籽原花青素提取條件的優(yōu)化是可行的，得到的野生毛葡萄籽原花青素提取條件具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

4 結(jié)論與討論

本研究先對(duì)野生毛葡萄籽進(jìn)行提取預(yù)處理，以野生毛葡萄籽提取液吸光度A500nm為量化指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上將響應(yīng)面法應(yīng)用到野生毛葡萄籽原花青素的提取。結(jié)果表明乙醇濃度、料液比和提取溫度對(duì)原花青素提取率的影響顯著，且不是簡(jiǎn)單的線形關(guān)系。通過(guò)回歸分析和驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明，此方法是合理可行的。得到原花青素最佳的提取條件為乙醇濃度64%、料液比1∶7、提取溫度35℃，最終試驗(yàn)值與理論預(yù)測(cè)值很接近，在此條件下，野生毛葡萄籽原花青素提取量為85.54mg·g-1，提取率為8.55%。

傳統(tǒng)的數(shù)理統(tǒng)計(jì)方法一般采用正交設(shè)計(jì),可同時(shí)考慮多種因素,尋求最佳因素組合,但不能在給出的整個(gè)區(qū)域上找到因素和響應(yīng)值之間的一個(gè)明確的函數(shù)表達(dá)式,從而無(wú)法找到整個(gè)區(qū)域上因素的最佳組合和響應(yīng)值的最優(yōu)值。響應(yīng)面分析方法是通過(guò)中心組合試驗(yàn)研究幾種試驗(yàn)因素間交互作用的一種回歸分析方法,具有試驗(yàn)次數(shù)少、周期短,求得的回歸方程精度高等優(yōu)點(diǎn),隨著計(jì)算機(jī)技術(shù)的發(fā)展,這種方法已經(jīng)成為精度高、應(yīng)用廣，并具有實(shí)用價(jià)值的技術(shù)。由試驗(yàn)結(jié)果可知，響應(yīng)面優(yōu)化的提取率為8.55%，高于各個(gè)單因素法提取率。因此可以考慮采用響應(yīng)面優(yōu)化法得到理論上的提取最高值。

[1] 國(guó)植，徐莉.原花青素：具有廣闊發(fā)展前景的植物藥[J].國(guó)外醫(yī)藥：植物藥分冊(cè)，1996(5):196-203.

[2] Mitsunaga T,Doi T,Kondo Y,et al.Color development of proantho-cyanidins in vanillin hydrochloric acid reaction[J].J.Wood Sci.,1998(44):125-130.

[3] 孫蕓,谷文英.硫酸 — 香草醛法測(cè)定葡萄籽原花青素含量[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2003,29(9):44-46.

(責(zé)任編輯：唐效蓉)

(英文編譯：張 珉)

OptimizationforethanolextractionofproanthocyanidinsfromVitisquinquangularisusingresponsesurfacemethod

TU Jia, DENG Xueliang, LI Zhonghai, XUE Minmin

(College of Food Science & Project Engineering, Central South University of Forestry and Technology, Changsha 410004, China)

The ethanol extraction technology of proanthocyanidins from seeds ofVitisquinquangulariswas studied using response surface method, and ethanol concentration(A)，solid-liquid ratio(B) and temperature(C) were selected as experimental factors. Based on analysis of significance and interaction among different factors, the optimum condition of ethanol extraction technology was obtained as followed: ethanol concentration was 64%，solid-liquid ratio was 1∶7 and temperature was 35℃。The mathematical model of proanthocyanidins extraction wasY=0.61-0.058A+0.029B-0.12C+0.025AC-0.013BC-0.091A2-0.095B2-0.17C2. And the predicted value and measured value of proanthocyanidins yield were 86.95mg·g-1and 85.54mg·g-1, respectively. So the obtained model is credible and could be used for actual prediction.

seeds ofVitisquinquangularis; proanthocyanidins; ethanol extraction; response surface method; optimization

2009 — 12 — 15

2010 — 01 — 26

R 284.2

A

1003 — 5710(2010)01 — 0001 — 06