虞 龍 苗秀珍 于 洋 張 民 陽(yáng) 振 葉琳琳 孔繁翔

(1.南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，南京，210009;2.中國(guó)科學(xué)院南京地理與湖泊研究所，湖泊與環(huán)境國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京，210008)

應(yīng)用新型調(diào)制熒光成像系統(tǒng)(Imaging-PAM)原位評(píng)估底泥毒性的方法*

虞 龍1＊＊苗秀珍1于 洋2張 民2陽(yáng) 振2葉琳琳2孔繁翔2

(1.南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，南京，210009;2.中國(guó)科學(xué)院南京地理與湖泊研究所，湖泊與環(huán)境國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京，210008)

應(yīng)用新型調(diào)制葉綠素?zé)晒獬上裣到y(tǒng)Imaging－PAM，通過(guò)最大葉綠素?zé)晒饬孔赢a(chǎn)量(Fv/Fm)、實(shí)際熒光量子產(chǎn)量(YⅡ)指標(biāo)的測(cè)定原位評(píng)估了友誼河底泥對(duì)斜生柵藻(Scenedesmus obliqnus)的毒性效應(yīng).數(shù)據(jù)顯示，在友誼河底泥懸浮液中，柵藻的Fv/Fm和YⅡ值在12h前快速上升，12h后呈現(xiàn)出時(shí)間－效應(yīng)型曲線，72h時(shí)Fv/Fm和YⅡ分別下降至對(duì)照的44%和35%，F(xiàn)v/Fm和YⅡ的半抑制時(shí)間分別為57h和45h.同時(shí)，通過(guò)對(duì)友誼河底泥樣品中重金屬含量的檢測(cè)，計(jì)算地積累指數(shù)(Igeo)，得出友誼河底泥中的Hg、Zn和Cu分別為嚴(yán)重污染，重污染和偏重污染水平，這可能是影響藻類(lèi)光合作用的主要污染物.本研究為進(jìn)行底泥毒性評(píng)估提供了新的原位分析方法.

斜生柵藻，底泥毒性，葉綠素?zé)晒饬孔赢a(chǎn)量，Imaging－PAM.

目前，沉積物生物評(píng)估進(jìn)展緩慢，其原因主要是由于檢測(cè)手段的限制，很難將測(cè)試種群(如藻類(lèi)、細(xì)菌)與沉積物顆粒有效區(qū)分并進(jìn)行生理生化水平的檢測(cè).而使用沉積物浸出液的傳統(tǒng)方法又不可避免地會(huì)出現(xiàn)氧化還原、金屬形態(tài)的變化、膠體的破壞等諸多問(wèn)題，與真實(shí)環(huán)境差異較大.新型調(diào)制熒光成像系統(tǒng)(Imaging－PAM)是結(jié)合Microscopy版探頭與特制熒光顯微鏡的一種在線葉綠素?zé)晒夥治鱿到y(tǒng)，可以探測(cè)和研究植物光合生理狀況及各種外界因子對(duì)其細(xì)微影響.此技術(shù)具有功能強(qiáng)大，操作極其簡(jiǎn)單快速，對(duì)受測(cè)試的藻體無(wú)損傷以及測(cè)量結(jié)果在屏幕上可見(jiàn)的優(yōu)點(diǎn)，不僅如此還可以對(duì)底泥進(jìn)行原位的生物分析，已經(jīng)在水生生物和高等植物上有所應(yīng)用［1－2］.2004年Ralph等人用它來(lái)研究海草的動(dòng)力學(xué)［3］，2005年P(guān)odola等人以微藻做指示生物，以調(diào)制葉綠素?zé)晒鉃橹笜?biāo)，結(jié)合熒光成像技術(shù)批次檢測(cè)揮發(fā)性有機(jī)污染物［4］.在國(guó)內(nèi)Imaging－PAM主要用于考察玉米、冬小麥、麻楓樹(shù)、木蘭植物、三裂葉蟛蜞菊等逆境脅迫下高等植物葉綠素?zé)晒獾淖兓?－9］.林阿朋等運(yùn)用Microscopy－Imaging－PAM對(duì)青島海域漂浮和沉降滸苔進(jìn)行光合作用研究［10］.

本文應(yīng)用Imaging－PAM技術(shù)，通過(guò)顯微鏡成像系統(tǒng)對(duì)底泥顆粒和柵藻細(xì)胞進(jìn)行區(qū)分，根據(jù)柵藻細(xì)胞光合作用變化原位評(píng)估底泥毒性，為水污染控制提供參考.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

斜生柵藻(Scenedesmus obliqnus)采用BG11培養(yǎng)基，在250ml的三角瓶中加入100ml的培養(yǎng)液，培養(yǎng)溫度(26±1)℃，光照強(qiáng)度為(30±10)μmol·m－2·s－1，光暗比為12∶12，靜置培養(yǎng)，每天早晚定時(shí)振蕩兩次.

1.2 底泥的采集與處理

2009年5月在南京選擇重金屬污染較嚴(yán)重友誼河－友誼橋附近采集底泥樣品，并以玄武湖東南湖灣較為干凈的底泥作為對(duì)照.使用底泥采樣器采集沉積物上層0—3cm深處100g泥樣，手工挑除石子，貝殼等雜質(zhì).為減少采樣誤差，每個(gè)采樣點(diǎn)附近分別采集底泥樣3個(gè)，混合后分別密封于無(wú)毒聚氯乙烯袋或桶中，帶回實(shí)驗(yàn)室4℃保存.

把采集來(lái)的底泥冷凍干燥后，稍加研磨后用250目篩過(guò)濾后得淤泥和沙，將泥沙比例固定在1∶9得到最終泥樣.經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)，沉積物濃度優(yōu)化以10%濃度為最佳，即9ml的水(經(jīng)0.45μm膜過(guò)濾)中加入1g泥樣.取3支30ml的聚碳酸酯管分別加入最終泥樣1g，分別向各樣品管輕輕加入9ml的水(經(jīng)0.45μm膜)過(guò)濾.

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

無(wú)菌條件下取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的斜生柵藻藻液適量用蒸餾水沖洗和離心(4000r·min－1，5min)3次后接入樣品管，使初始藻細(xì)胞的密度為(5—9)×105個(gè) cell·ml－1，于3h，12h，24h，36h，48 h和72h 脅迫培養(yǎng).光照強(qiáng)度為(30±10)μmol·m－2·s－1，溫度為(26±1)℃，光暗比為12∶12.

利用調(diào)制熒光成像系統(tǒng)Imaging－PAM(Walz，Germany)測(cè)定PSII的最大量子產(chǎn)額(Fv/Fm)以及實(shí)際量子產(chǎn)率－YⅡ.分別在0 h，3h，12h，24h，36h，48 h和72h后取不同處理組的藻培養(yǎng)液10μl于載玻片上進(jìn)行測(cè)定，每處理取3個(gè)平行，每個(gè)平行5個(gè)視野，每個(gè)視野隨機(jī)選擇15—20個(gè)藻細(xì)胞圈定見(jiàn)圖1，取其熒光動(dòng)力學(xué)參數(shù)的平均值，測(cè)定之前樣品至少暗適應(yīng)15 min，所有操作均在背景光強(qiáng)低于1μmol·m－2·s－1的環(huán)境中進(jìn)行.儀器的作用光強(qiáng)度均設(shè)為默認(rèn)值80 μmol·m－2·s－1，測(cè)量光低于0.5 μmol·m－2·s－1，增益設(shè)置為9.暗適應(yīng)后的最大光合效率Fv/Fm，光適應(yīng)下的實(shí)際效率YⅡ的計(jì)算按文獻(xiàn)公式由儀器自動(dòng)給出［11］.

圖1 底泥懸浮液中柵藻細(xì)胞的熒光圖像(200倍放大)Fig.1 The fluorescence image of Scenedesmus obliquus cells in sediment suspension(amplification of 200)

1.4 重金屬離子的測(cè)定

取底泥樣品2—3g為佳.瑪瑙研缽粉碎至≤200目，存放于紙質(zhì)樣品袋中，105℃以下烘干.鹽酸硝酸氫氟酸高氯酸敞開(kāi)消解.用電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜儀(ICP－AES)檢測(cè)出6個(gè)對(duì)柵藻生長(zhǎng)敏感的重金屬元素(Co，Cu，Mn，Ni，Pb，Zn)的數(shù)據(jù)，用來(lái)檢測(cè)底泥中Hg元素的樣品只需用瑪瑙研缽粉碎至≤100目，在50℃以下烘干用CVAAS方法在直接汞分析儀上測(cè)出.

2 結(jié)果與討論

2.1 不同位點(diǎn)底泥懸浮液中柵藻光合作用指標(biāo)的變化

柵藻在污染底泥中脅迫0h，3h，12h，24h，36h，48 h和72h后Fv/Fm的變化見(jiàn)圖2，F(xiàn)v/Fm在3h時(shí)下降為對(duì)照組的72%，在12h上升與對(duì)照相當(dāng)，在12h后又開(kāi)始下降，在24h，48h，72h時(shí)分別為對(duì)照的73%，57%，44%.在72h時(shí)其值為0.29.

柵藻在污染底泥中脅迫0 h，3h，24h，36h，48 h和72h后在第一個(gè)飽和脈沖條件下的YⅡ(Yi)值的變化見(jiàn)圖2.YⅡ在3h時(shí)快速的下降，為對(duì)照組的63%，在12h上升為對(duì)照的76%，在12h后又開(kāi)始下降，在72h時(shí)其值為0.23，是對(duì)照的35%.

本實(shí)驗(yàn)除了以量子產(chǎn)量為衡量指標(biāo)，也應(yīng)用了快速光響應(yīng)技術(shù)，在不同處理時(shí)間的底泥懸浮溶液中測(cè)定柵藻細(xì)胞的相對(duì)電子傳遞速率(rETR)的快速光響應(yīng)曲線見(jiàn)圖3.各處理組的rETR值隨光照強(qiáng)度的增加呈逐漸增加趨勢(shì);在12h時(shí)柵藻細(xì)胞的rETR光響應(yīng)曲線增加趨勢(shì)與對(duì)照相當(dāng)，隨著脅迫時(shí)間越長(zhǎng)，增加趨勢(shì)越緩慢，表明隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，柵藻植株耐光抑制能力顯著降低.

圖2 不同時(shí)間底泥懸浮液Fv/Fm與YⅡ的變化Fig.2 Changes of Fv/Fm and YⅡin sediment suspension with exposure time

圖3 不同光強(qiáng)下底泥懸浮液表觀電子傳遞速率(mean±se)的變化Fig.3 Changes of rETR(mean ± se)in sediment suspension under various light intensity

12h后的脅迫時(shí)間，無(wú)論是Fv/Fm還是YⅡ值都表現(xiàn)出時(shí)間－效應(yīng)曲線的變化規(guī)律，可計(jì)算出在這一時(shí)間段內(nèi)底泥懸浮液中柵藻細(xì)胞經(jīng)脅迫后的半抑制時(shí)間，柵藻細(xì)胞在友誼河底泥懸浮液中連續(xù)暴露72h時(shí)間內(nèi)Fv/Fm和YⅡ熒光指標(biāo)的半抑制時(shí)間分別為57h和45h.

最大光量子產(chǎn)量Fv/Fm，即PSⅡ原初光能轉(zhuǎn)換效率是衡量PSII完整性的指標(biāo).在正常生理狀態(tài)下，F(xiàn)v/Fm是一個(gè)很穩(wěn)定的值，藻類(lèi)約為0.65［12］.當(dāng)藻類(lèi)受到脅迫時(shí)，其值顯著下降［13］.YⅡ則是光系統(tǒng)Ⅱ的有效量子產(chǎn)量，表示植物體光合機(jī)構(gòu)將吸收的光能進(jìn)行轉(zhuǎn)化的能力.而相對(duì)電子傳遞速率(rETR)是反映實(shí)際光強(qiáng)下吸收的光能沿光合電子傳遞鏈被傳遞利用的多少，可以在相當(dāng)程度上反映植物的光合速率的大?。?4－15］.

經(jīng)毒性底泥懸浮液脅迫后的柵藻細(xì)胞的葉綠素?zé)晒庵笜?biāo)Fv/Fm，YⅡ和rETR與對(duì)照相比在3—12h內(nèi)迅速下降后再顯著升高，其中Fv/Fm和rETR在12h時(shí)與對(duì)照相當(dāng).三者在12h后又開(kāi)始降低，在短時(shí)間0—3h內(nèi)有可能是沉積物顆粒遮擋了藻細(xì)胞而影響藻細(xì)胞的光合作用從而抑制其生長(zhǎng)，柵藻細(xì)胞對(duì)于這種泥水混合的環(huán)境一時(shí)還難以適應(yīng)，表現(xiàn)為光合作用下降.之后到12h時(shí)底泥懸浮液對(duì)于柵藻的生長(zhǎng)沒(méi)有表現(xiàn)毒性反而促進(jìn)其生長(zhǎng)，可能的原因是底泥中毒性物質(zhì)的釋放量還很少呈現(xiàn)為Hormesis現(xiàn)象(毒物興奮效應(yīng))，與Calabreseh和Baldwin的雙相劑量－反應(yīng)模式符合［16］，還有一種可能是由于沉積物會(huì)釋放出營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)最初可以促進(jìn)藻的生長(zhǎng)，潛在地遮蔽了污染物的毒性效應(yīng)［17］.隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，底泥中重金屬離子釋放增加，改變?cè)|(zhì)膜的滲透性，使K+從細(xì)胞內(nèi)喪失，影響藻類(lèi)的生長(zhǎng)和光合作用［18］.在72h時(shí) Fv/Fm 和 YⅡ分別降低到0.29和0.23.Schansker等發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)v/Fm 值大于0.44時(shí)，PSⅡ活性隨著Fv/Fm的降低而降低，當(dāng)小于0.44時(shí)就完全失去活性，表現(xiàn)出反應(yīng)中心的破壞，光合效率降低［19］.

2.2 不同位點(diǎn)底泥中地積累指數(shù)與污染程度

考慮到友誼河多年來(lái)接納了兩岸的工業(yè)廢水和生活污水，而多種污染物中重金屬離子作用尤為明顯.為了對(duì)水質(zhì)污染程度進(jìn)行大致的評(píng)價(jià)并與藻類(lèi)毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果相比較，我們以常用的地積累指數(shù)(Igeo)［20］來(lái)對(duì)沉積物中重金屬的污染程度進(jìn)行評(píng)價(jià).表1列出了友誼河底泥中主要重金屬含量及重金屬地球化學(xué)背景值(采用中國(guó)土壤元素的幾何平均值，mg·kg－1)，以及運(yùn)用地積累指數(shù)(Igeo)算出的友誼河主要重金屬元素的污染情況.從表1中可以看出，友誼河底泥中Hg，Zn和Cu元素的含量很高，達(dá)到重污染的水平.

重金屬離子對(duì)于藻類(lèi)有嚴(yán)重的脅迫作用，能引起藻類(lèi)生理代謝功能紊亂，減少細(xì)胞色素，抑制光合作用致使葉綠素?zé)晒庵底兊?因此柵藻細(xì)胞光合作用下降可能主要來(lái)源于Hg，Zn和Cu等離子的聯(lián)合作用.這與Mallick和Mohn發(fā)現(xiàn)的斜生柵藻暴露于含Cu，Cr，Ni，Cd，Zn等重金屬的水體中12h后Fv/Fm下降的結(jié)果相一致［21］.

表1 友誼河主要重金屬元素含量及污染情況Table 1 Main heavy metal concentrations and pollution grades in Friendship River sediment

3 結(jié)論

本研究運(yùn)用調(diào)制熒光成像系統(tǒng)Imaging－PAM檢測(cè)污染底泥中柵藻光合作用的變化，得出在重金屬離子為主的底泥污染物作用下，柵藻的Fv/Fm和YⅡ值在12h前快速上升，12h后呈現(xiàn)出時(shí)間－效應(yīng)型曲線;相對(duì)電子傳遞速率(rETR)隨光照強(qiáng)度的增加呈逐漸增加趨勢(shì)，隨著脅迫時(shí)間越長(zhǎng)，增加趨勢(shì)緩慢.由此可見(jiàn)，Imaging－PAM作為一種新型的在線葉綠素?zé)晒夥治黾夹g(shù)可以原位快捷地應(yīng)用于沉積物污染評(píng)估，為環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)進(jìn)一步接近真實(shí)環(huán)境提供一定基礎(chǔ).

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AN IN-SITU ASSESSMENT OF SEDIMENT TOXICITY WITH THE APPLICATION OF IMAGING-PAM

YU Long1MIAO Xiuzhen1YU Yang2ZHANG Min2YANG Zhen2YE Linlin2KONG Fanxiang2
(1.College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering，Nanjing University of Technology，Nanjing，210009，China;2.Nanjing Institute of Geography＆ Limnology，Chinese Academy of Sciences，State Key Laboratory of Lake Science and Environment，Nanjing，210008，China)

New modulated chlorophyll fluorescence imaging system Imaging－PAM has been applied as an effective detection in short－term bioassays with Scenedesmus obliquus. Maximum quantum yield of chlorophyll fluorescence(Fv/Fm)and the actual fluorescence quantum yield(YⅡ)were used to assess the toxicity of the sediment from Youyi River.Data showed that in 12h exposure there was a rapid increase in Fv/Fm and YⅡof Scenedesmus obliquus in the sediment suspension of Youyi River，whereas after 12h a time－response curve appeared.In 72h the Fv/Fm and YⅡdropped to 44%and 35%of that of the control respectively，the halfinhibition time of Fv/Fm and YⅡwere 57h and 45h.At the same time by detecting the concentration of heavy metals in the sediment of Youyi River，the index of geoaccumulation(Igeo)was accounted as follows:Hg，Zn，and Cu reached serious pollution，heavy pollution and partial heavy pollution levels respectively.They are the probobly the primary contaminants affecting the photosynthesis of algae.This study may provide a new method to assess the toxicity of sediment in situ.

Scenedesmus obliquus，in－situ assessment of sediment toxicity，quantum yield of chlorophyll fluorescence，Imaging－PAM.

2009年12月24日收稿.

*國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(20807043);中國(guó)科學(xué)院南京地理與湖泊研究所所長(zhǎng)基金(07SL021001)資助.

＊＊通訊聯(lián)系人，Tel:15850560573;E－mail:bilbobaggins@126.com