黃 斌 潘學(xué)軍 劉晶靚 方 鍇 王 宇 高建培

(昆明理工大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院,昆明,650093)

類固醇類內(nèi)分泌干擾物羥基衍生化條件的優(yōu)化

黃 斌 潘學(xué)軍＊＊?jiǎng)⒕ъn 方 鍇 王 宇 高建培

(昆明理工大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院,昆明,650093)

以 N-甲基-N-三甲基硅基三氟乙酰胺 (MSTFA)為衍生化試劑,采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù) (GCMS)系統(tǒng)研究了 4種類固醇類內(nèi)分泌干擾物雌酮 (E1)、17β-雌二醇 (E2)、雌三醇 (E3)、17α-乙炔基雌二醇(EE2)的羥基衍生化,主要考察了MSTFA用量、衍生化溫度、衍生化時(shí)間對(duì)類固醇類內(nèi)分泌干擾物衍生化效果的影響以及衍生化產(chǎn)物的穩(wěn)定性、標(biāo)準(zhǔn)曲線、儀器檢出限等.結(jié)果表明:100μl濃度為0.01μg·μl-1的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液,MSTFA的最佳用量為 20μl;最佳衍生化條件為 70℃下反應(yīng) 30min;衍生化產(chǎn)物的穩(wěn)定性較好,在 -20℃下放置 48h,相對(duì)響應(yīng)因子 (RRF)基本沒有降低;在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下,各待測(cè)物具有良好的線性相關(guān)性,E1和 E2的儀器檢出限為 0.1pg·μl-1,EE2和 E3的儀器檢出限為 1pg·μl-1.

類固醇,內(nèi)分泌干擾物,羥基,衍生化,MSTFA.

類固醇類內(nèi)分泌干擾物 (Steroids Endocrine Disrupting Chemicals)是由膽固醇合成的一種生物活性物質(zhì),具有類固醇類環(huán)[1],這類物質(zhì)化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定,相對(duì)其它環(huán)境內(nèi)分泌干擾物,有更強(qiáng)的內(nèi)分泌干擾作用,與人工合成的化學(xué)物質(zhì)相比,對(duì)生態(tài)環(huán)境影響尤其顯著[2],即使環(huán)境濃度在 0.1ng·l-1以下也會(huì)對(duì)生物體造成危害[3].類固醇類內(nèi)分泌干擾物難降解、高親脂性、殘留期長(zhǎng)等特性使得此類物質(zhì)可通過生物富集和食物鏈的放大作用在生物體內(nèi)積累,形成區(qū)域性或全球性的威脅,對(duì)生態(tài)系統(tǒng)及人類造成極大的危害,直接影響到生物體生命延續(xù).

在過去十多年中,多個(gè)國(guó)家的研究小組用不同的方法監(jiān)測(cè)這類物質(zhì)在污水處理廠的進(jìn)水和出水中以及在河流、湖泊中的存在狀況[4—7],以此評(píng)價(jià)污水處理效率和環(huán)境風(fēng)險(xiǎn).但是由于其在水中的濃度極低,通常為 ng·l-1甚至 pg·l-1級(jí),以及水體中復(fù)雜基質(zhì)的干擾,使得類固醇類內(nèi)分泌干擾物的監(jiān)測(cè)難度較大,目前就世界范圍來說還處于起步階段,沒有現(xiàn)成的標(biāo)準(zhǔn)分析方法.在各種分析技術(shù)中,氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)以其很好的檢測(cè)靈敏度和相對(duì)較低的運(yùn)行成本一直受到環(huán)境中痕量有機(jī)污染物分析的青睞[8—11].但是由于類固醇類內(nèi)分泌干擾物基本上都含有羥基官能團(tuán),極性較大,直接用 GC-MS分析,在氣相色譜柱內(nèi)容易產(chǎn)生吸附,從而使檢出值比實(shí)際值偏低,靈敏度下降,不適合痕量分析,需通過衍生化轉(zhuǎn)化成極性較低、更易揮發(fā)且熱穩(wěn)定性好的衍生物,從而提高檢測(cè)靈敏度和改善色譜峰形[7,12,13].因此類固醇類內(nèi)分泌干擾物羥基衍生化技術(shù)的發(fā)展,成為 GC-MS應(yīng)用于分析檢測(cè)此類物質(zhì)的核心技術(shù).雖然目前國(guó)內(nèi)外對(duì)類固醇類內(nèi)分泌干擾物的羥基衍生化進(jìn)行了一些探討[6,7,14—17],但是缺少系統(tǒng)的研究.

本研究采用 GC-MS技術(shù),以N-甲基-N-三甲基硅基三氟乙酰胺 (MSTFA)為衍生化試劑研究了具有代表性的 4種類固醇類內(nèi)分泌干擾物雌酮 (Estrone,E1)、17β-雌二醇 (17β-Estradiol,E2)、17α-乙炔基雌二醇 (17α-ethynylestradoil,EE2)和雌三醇 (Estriol,E3)的羥基衍生化,主要考察了MSTFA用量、衍生化溫度、衍生化時(shí)間對(duì)衍生化效果的影響以及衍生化產(chǎn)物的穩(wěn)定性、標(biāo)準(zhǔn)曲線、儀器檢出限等.

1 材料與方法

1.1 標(biāo)準(zhǔn)品與試劑

類固醇類內(nèi)分泌干擾物的標(biāo)準(zhǔn)品 (E1,E2,EE2,E3)和雄烷 (內(nèi)標(biāo)),純度為 97%—99%,Sigma-Aldrich公司;衍生化試劑MSTFA(衍生化級(jí))和吡啶 (色譜純),Fluka公司;溶劑甲醇、二氯甲烷、正己烷為色譜純,Fisher公司.

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液:稱取 E1,E2,E3,EE2,內(nèi)標(biāo)各 40mg,分別溶于 40ml甲醇中,配成 1.0μg·μl-1的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,放入冰箱冷凍待用(-20℃).實(shí)驗(yàn)中根據(jù)不同需要稀釋成所需濃度.

標(biāo)準(zhǔn)混合溶液:分別從濃度為 1.0μg·μl-1的 E1,E2,EE2,E3標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液中移取 100μl,加入9.6ml甲醇,混合后配成 0.01μg·μl-1的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液,放入冰箱冷凍待用 (-20℃).實(shí)驗(yàn)中根據(jù)不同需要稀釋成所需濃度.

1.2 GC-MS實(shí)驗(yàn)條件

使用 Ther mo Trace DSQ(美國(guó)熱電公司)GC-MS儀器.GC參數(shù):色譜柱為 DB-5MS毛細(xì)管柱(30m ×0.25mm ×0.25μm,美國(guó) J&W Scientific);以氦氣為載氣,流速為 1ml·min-1;不分流方式進(jìn)樣,進(jìn)樣口溫度為 280℃,進(jìn)樣體積 1μl;升溫程序?yàn)?初始溫度 50℃,保持 2min,以 12℃·min-1的速率上升到 260℃,保持 8min,然后再以 3℃·min-1的速率上升到 280℃,保持 5min.MS參數(shù):接口溫度為 280℃,傳輸線溫度為 300℃,離子源溫度為 250℃,電離方式為 EI,電子轟擊能量為 70 eV,溶劑延遲時(shí)間為 12min,以全掃描模式定性,掃描范圍 m/z 50—600,以選擇離子掃描模式(S IM)定量.

1.3 衍生化實(shí)驗(yàn)

取 100μl一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液于 1.5ml色譜進(jìn)樣瓶中,放入氮吹儀中通入高純氮?dú)?99.999%)緩慢吹干,然后加入 20μlMSTFA和 50μl吡啶,混合后在一定溫度下反應(yīng)一定的時(shí)間,吹干,加入 90μl進(jìn)樣溶劑 (二氯甲烷 /正己烷:1/4,V/V)和 10μl濃度為 0.01μg·μl-1的內(nèi)標(biāo),取1μl注入 GC-MS分析.

由于在衍生化過程中,衍生化試劑用量、衍生化時(shí)間、衍生化溫度等均對(duì)衍生化產(chǎn)物有一定的影響,因此對(duì)于含有多個(gè)羥基的化合物,衍生化可能會(huì)不完全,僅對(duì)其中的一個(gè)或兩個(gè)羥基有效.E1,E2,EE2,E3及其在衍生化過程中所有可能產(chǎn)生的衍生化產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)圖見圖1,實(shí)驗(yàn)過程中要控制衍生化條件,盡量使待測(cè)物中的羥基全部衍生化.

圖1 E1,E2,EE2,E3及其衍生化產(chǎn)物化學(xué)結(jié)構(gòu)圖Fig.1 Chemical structures of E1,E2,EE2,E3 and their derivatives

2 結(jié)果與討論

2.1 衍生化產(chǎn)物色譜圖

取 100μl濃度為 0.01μg·μl-1的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液于 1.5ml色譜進(jìn)樣瓶中,放入氮吹儀中通入高純氮?dú)饩徛蹈?然后加入 20μlMSTFA和 50μl吡啶,混合后在 70℃下反應(yīng) 30min,吹干,加入 90μl進(jìn)樣溶劑和 10μl濃度為 0.01μg·μl-1的內(nèi)標(biāo),取 1μl注入 GC-MS分析.分析結(jié)果如圖2B所示.

圖2 類固醇類內(nèi)分泌干擾物標(biāo)準(zhǔn)品 (A)和衍生化產(chǎn)物 (B)的總離子色譜圖 (全掃描)Fig.2 Total ion chromatogram of steroid endocrine disrupting chemicals(A)and their derivatives(B)(Scan)

E1,E2,EE2,E3與MSTFA反應(yīng)后,羥基全部衍生化,相應(yīng)生成 T MS-E1,di-T MS-E2,di-T MSEE2,tri-T MS-E3,與未衍生化時(shí)相比 (圖2A),E3經(jīng)衍生化后峰形明顯提高,相對(duì)豐度由未衍生化時(shí)的不足 5%提高到 58%,峰面積提高了 159倍,E1和 E2的保留時(shí)間差也從 0.31min提高到0.68min,分離效果提高顯著,E1,E2和 EE2峰面積分別提高了 3.09,3.96和 4.02倍.T MS-E1,di-T MS-E2,di-T MS-EE2,tri-T MS-E3在 S IM模式下檢測(cè)的特征離子分別為 m/z 342,327,285,m/z 416,401,285,m/z 440,425,285,m/z 504,489,285.

2.2 MSTFA用量的確定

對(duì)于 100μl濃度為 0.01μg·μl-1的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液,70℃下與 MSTFA反應(yīng) 30min,衍生化產(chǎn)物的RRF(相對(duì)響應(yīng)因子,即待測(cè)物峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值)隨MSTFA用量的變化曲線如圖3所示.當(dāng)MSTFA用量為 5μl時(shí),E1僅有部分被衍生化成 T MS-E1,且能檢測(cè)到 E1的存在,E2雖衍生化生成 di-T MS-E2,但峰很低,相對(duì)豐度只有 20%,尚有很大部分未被衍生化,EE2也只被部分衍生化成mono-T MS-EE2,E3則完全未被衍生化.E1,E2,EE2衍生化的那部分羥基主要是在 C3位上,可見,對(duì)于以MSTFA為衍生化試劑的衍生化反應(yīng),芳香烴上羥基的衍生化也優(yōu)先于脂肪烴上的羥基.隨著MSTFA用量的增加,有更多的羥基被衍生化,E1,mono-T MS-EE2,E3逐漸向 T MS-E1,di-T MS-EE2和 tri-T MS-E3轉(zhuǎn)化,di-T MS-E2的相對(duì)豐度也逐漸增加.當(dāng)MSTFA用量增大到 15μl時(shí),各物質(zhì)上的羥基都已基本上被衍生化,峰面積也都顯著增大,再增加MSTFA用量,峰形變化不大,基本趨于穩(wěn)定.當(dāng)用量達(dá)到 20μl時(shí),各衍生化產(chǎn)物的 RRF達(dá)到最大.因此,對(duì)于 100μl濃度為 0.01μg·μl-1標(biāo)準(zhǔn)混合溶液,MSTFA的最佳用量為 20μl.

2.3 衍生化溫度的優(yōu)化

取 100μl濃度為 0.01μg·μl-1的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液,吹干后加入 20μlMSTFA和 50μl吡啶,不同溫度下反應(yīng) 30min,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示.在不加熱的條件下 (常溫反應(yīng)),E1,E2,E3的羥基全被衍生化,相應(yīng)地生成 T MS-E1,di-T MS-E2和 tri-T MS-E3,EE2除被衍生化成 di-T MS-EE2,還有部分未被完全衍生化,生成了 mono-T MS-EE2,當(dāng)在 60℃加熱 30min后,mono-T MS-EE2消失,EE2已被完全衍生化成 di-T MS-EE2,各衍生化產(chǎn)物的 RRF在 70℃達(dá)到最大,隨著溫度的進(jìn)一步升高,各衍生化產(chǎn)物的 RRF都在降低,到 90℃時(shí),檢測(cè)不到 EE2的衍生化產(chǎn)物,可能是溫度過高使得 di-T MS-EE2分解,因此,70℃為最佳衍生化溫度.

圖3 衍生化產(chǎn)物的 RRF隨MSTFA用量的變化曲線圖Fig.3 Comparison of the RRF values for steroid derivatives at different amount ofMSTFA

圖4 衍生化產(chǎn)物的 RRF隨衍生化溫度的變化曲線圖Fig.4 Comparison of the RRF values for steroid derivatives at different reaction temperature

2.4 衍生化時(shí)間的優(yōu)化

取 100μl濃度為 0.01μg·μl-1的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液,吹干后加入 20μlMSTFA和 50μl吡啶,70℃下反應(yīng)不同的時(shí)間,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示.E1,E2,E3的羥基在衍生化時(shí)間為 0min時(shí) (與MSTFA和吡啶混合后立即吹干加進(jìn)樣溶劑和內(nèi)標(biāo)直接進(jìn)樣)就已全被衍生化成 T MS-E1,di-T MS-E2和 tri-T MS-E3,EE2衍生化不完全,有部分被衍生化成 mono-T MS-EE2,當(dāng)在 70℃加熱下 10min后,mono-T MS-EE2全部轉(zhuǎn)化成 di-T MS-EE2,di-T MS-EE2的 RRF在 30min后達(dá)到最大并基本趨于穩(wěn)定,其余各衍生化產(chǎn)物的 RRF在整個(gè)衍生化時(shí)間范圍內(nèi)變化不大,因此,30min為最佳加熱時(shí)間.

2.5 衍生化產(chǎn)物的穩(wěn)定性

取 100μl濃度為 0.01μg·μl-1的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液,吹干后加入 20μlMSTFA和 50μl吡啶,混合后吹干,加入 90μl進(jìn)樣溶劑和 10μl內(nèi)標(biāo) (0.01μg·μl-1),然后將其置于 -20℃冰箱中,分別于 0h,3h,6h,12h,24h,36h和 48h取出進(jìn)樣檢測(cè),所得結(jié)果如圖6所示.從圖6中可以看出,E1,E2,EE2,E3經(jīng)過衍生化后,衍生物穩(wěn)定性較好,在放置 48h后 RRF仍沒有明顯降低.

圖5 衍生化產(chǎn)物的 RRF隨衍生化時(shí)間的變化曲線圖Fig.5 Comparison of the RRF values for steroid derivatives at different reaction time

圖6 衍生化產(chǎn)物的 RRF隨放置時(shí)間的變化曲線圖Fig.6 Comparison of the RRF values for steroid derivatives after different storage t ime

2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線及儀器檢出限

以 GC-MS在 S IM模式所測(cè)得各個(gè)濃度下衍生化產(chǎn)物的 RRF對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)樣濃度 (pg·μl-1)作線形回歸,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,其回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍及儀器檢出限見表1.結(jié)果表明,GC-MS檢測(cè)各化合物的線性相關(guān)性良好,E1和 E2的儀器檢出限為 0.1pg·μl-1,EE2和 E3的儀器檢出限為1.0pg·μl-1.

表1 回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍及儀器檢出限Table 1 Equation of linear regression,correlation coefficients,linear range, IQL

3 結(jié)論

MSTFA可以作為類固醇類內(nèi)分泌干擾物 E1,E2,EE2和 E3的羥基衍生化試劑,在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下,衍生化產(chǎn)物分別為 T MS-E1,di-T MS-E2,di-T MS-EE2和 tri-T MS-E3;對(duì)于 100μl濃度為0.01μg·μl-1的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液,MSTFA的最佳用量為 20μl;最佳衍生化條件為 70℃下反應(yīng) 30min;在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下,衍生化產(chǎn)物的穩(wěn)定性較好,各待測(cè)物具有良好的線性相關(guān)性,E1和 E2的儀器檢出限為 0.1pg·μl-1,EE2和 E3的儀器檢出限為 1.0pg·μl-1.

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OPT IM ISATI ON OF DERIVATISATI ON COND ITI ONS FOR STERO I D ENDOCRINE D ISRUPTING CHEM ICALS

HUANG B in PAN Xue-jun L IU Jing-liang FANG Kai WANG Yu GAO Jian-pei
(Faculty of Environmental Science and Engineering,KunmingUniversity of Science and Technology,Kunming,650093,China)

The derivatization of the hydroxyl groups in steroid endocrine disrupting chemicals,such as estrone(E1),17β-estradiol(E2),estriol(E3)and 17α-ethynylestradoil(EE2),with N-methyl-N-(trimethylsilyl)trifluoroacetamide(MSTFA)as derivatization reagent followed by gas chromatography-mass spectrometry(GCMS)was studied.The effects of the amount ofMSTFA,derivatization temperature and time on the derivatization of target compounds,as well as the stability of steroid derivatives,calibration curves and instrumental quantification l imits were systematically investigated.The results show that best derivatization results were obtained when the amount ofMSTFA was 20μl for 100μl steroids standard mix solution at 0.01μg·μl-1;the optimal derivatization condition was reaction at 70℃for 30min;The derivatives of target compounds were stable because their RRFs showed no observable change when kept at-20℃for 48h.Under the optimal condition,good linear correlation was obtained and the instrumental quantification limit was 0.1pg·μl-1for E1 and E2,while itwas 1pg·μl-1for EE2 and E3.

steroid,endocrine disrupting chemicals,hydroxyl groups,derivatization,MSTFA.

2009年5月9日收稿.

＊國(guó)家環(huán)保公益性行業(yè)科研專項(xiàng)基金(200809136);國(guó)家自然科學(xué)基金(20767002);教育部留學(xué)回國(guó)人員科研啟動(dòng)基金(教外司留[2008]890號(hào));云南省自然科學(xué)基金(2007B035M);云南省教育廳重點(diǎn)基金(07Z11057)資助.

＊＊通訊聯(lián)系人,Tel:0871-5189022;E-mail:xjpan@kmust.edu.cn