黃明進(jìn)，王文全，2*，沈壽茂

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100102；2.中藥材規(guī)范化生產(chǎn)教育部工程研究中心，北京 100102）

工藝研究

甘草總黃酮和總皂苷成分的提取工藝及其含量分析△

黃明進(jìn)1，王文全1，2*，沈壽茂1

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100102；2.中藥材規(guī)范化生產(chǎn)教育部工程研究中心，北京 100102）

目的：優(yōu)化甘草中總黃酮和總皂苷成分的提取工藝，并比較在不同品種和不同產(chǎn)地野生甘草藥材中的含量差異。方法：紫外分光光度計(jì)測定甘草總黃酮和總皂苷的含量，采用正交試驗(yàn)法，考察乙醇濃度、固液比、氨水濃度及超聲溫度對其提取率的影響，優(yōu)選出能同時提取兩類成分的合適工藝。結(jié)果：最佳提取工藝為乙醇濃度80%，固液比1∶20，氨水濃度0.3%及超聲溫度40℃；不同來源甘草藥材的總黃酮和總皂苷含量差異較大。結(jié)論：優(yōu)選的條件可靠，重現(xiàn)性好，適合甘草總黃酮和總皂苷的同時提取；測定甘草總黃酮和總皂苷含量能有效評價甘草藥材質(zhì)量。

甘草；總黃酮；總皂苷；正交試驗(yàn)；含量測定

甘草是常用中藥材，具有補(bǔ)脾益氣，清熱解毒，祛痰止咳，緩急止痛，調(diào)和諸藥的功能［1］，在醫(yī)療、食品、化妝品等行業(yè)中的應(yīng)用廣泛。甘草黃酮和皂苷是基本結(jié)構(gòu)不同的兩類化合物，也是甘草具有多種藥理作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，在甘草藥材中的含量較高，但在不同品種、不同產(chǎn)地甘草藥材中的含量差異較大，以往測定甘草總黃酮和總皂苷含量常以不同的提取分離方法分別進(jìn)行樣品處理，操作過程復(fù)雜，耗時較長［2，3］。本實(shí)驗(yàn)采用正交試驗(yàn)法，以甘草中總黃酮和總皂苷的含量為指標(biāo)，考察不同乙醇濃度、固液比、氨水濃度及超聲溫度對其提取率的影響，優(yōu)選出最佳提取工藝，使之最大限度提取完全，同時，還測定分析了兩類成分在不同來源野生甘草藥材中的含量差異。

1 材料

1.1 儀器

電子分析天平（Sartorius BS110S萬分之一，BP211D十萬分之一）；KQ500DE型數(shù)控超聲波清洗器；Hitachi U-2000型紫外分光光度計(jì)等。

1.2 試藥

甘草酸（中國藥品生物制品檢定所，批號110731），甘草苷（上?？稻呕び邢薰?，批號061009）；無水乙醇、氨水、氫氧化鉀、香草醛、冰醋酸、高氯酸等試劑均為分析純。

不同品種和不同產(chǎn)地野生甘草藥材，甘草Glycyrrhiza uralensisFisch.采集自西北地區(qū)（新疆、甘肅），中西部地區(qū)（內(nèi)蒙古、寧夏、陜西），東北地區(qū)（吉林、黑龍江）等地，每區(qū)取樣5份；在新疆采集甘草Glycyrrhiza uralensisFisch.、光果甘草Glycyrrhiza glabraL.、脹果甘草Glycyrrhiza inflataBat.各7份。以上藥材均由北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院王文全教授鑒定。

2 方法

2.1 甘草總黃酮和總皂苷的含量測定

方法［4，5］，對甘草總黃酮和總皂苷的含量進(jìn)行測定。

2.1.1 對照品溶液的配制 甘草苷儲備液：精密稱取甘草苷對照品4.65mg于10mL的容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得0.465mg·mL－1的甘草苷對照品儲備液。

甘草酸儲備液：精密稱取甘草酸對照品15.97mg于10mL的容量瓶中，用甲醇溶解，定容至刻度，即得1.597mg·mL－1的甘草酸儲備液。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線：精密吸取甘草苷儲備液0.05，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8mL依次置于10mL的容量瓶中，各加入70%甲醇溶液1mL搖勻后，再加10%NaOH 2.5mL顯色，10min后用70%甲醇溶液定容至刻度，在λ＝410nm下分別測定吸光度值，并以甘草苷質(zhì)量（mg）為自變量，吸光度為因變量，計(jì)算線性方程。

皂苷標(biāo)準(zhǔn)曲線：精密吸取甘草酸儲備液0.02，0.05，0.1，0.15，0.2，0.25mL于6個5mL的容量瓶中，揮干溶劑，加5%香草醛-冰醋酸溶液0.25mL，搖勻，加0.8mL高氯酸，搖勻，在55℃水浴反應(yīng)20min，取出自來水冷至室溫，定容至刻度，用不含儲備液的溶劑作為空白，在λ＝589nm下測定吸光度，并以甘草酸質(zhì)量（mg）為自變量，吸光度為因變量，計(jì)算線性方程。

2.2 正交試驗(yàn)因素與水平

2.2.1 提取方法選擇 提取甘草藥材中的成分常有浸漬法、水煎煮法、回流法、超聲波萃取法等［6］，這些方法中，超聲波萃取法快速、方便、操作簡單，在實(shí)驗(yàn)室中大都采用此方法對樣品進(jìn)行處理。因此，本實(shí)驗(yàn)采用超聲法進(jìn)行甘草成分的提取。

2.2.2 影響因素及水平選擇 影響萃取效率的因素主要有溶媒濃度、用量、超聲溫度和強(qiáng)度等，結(jié)合文獻(xiàn)報道［7］，本實(shí)驗(yàn)將溶劑濃度、固液比、加入氨水量、超聲溫度作為考察對象，并分別設(shè)3個水平，即4因素3水平，見表1。

表1 甘草總黃酮和總皂苷成分提取工藝因素水平表

2.3 試驗(yàn)方案與指標(biāo)測定

根據(jù)選擇的因素水平，按L9（34）正交試驗(yàn)表進(jìn)行試驗(yàn)安排，共有9組試驗(yàn)。按照試驗(yàn)號對應(yīng)的提取條件，分別稱取甘草粉末（20目）0.2g于25mL的容量瓶中進(jìn)行提取試驗(yàn)，每組重復(fù)3次，用繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線下的方法分別測定其總黃酮和總皂苷的含量。

2.4 不同甘草藥材總黃酮和總皂苷含量比較

根據(jù)優(yōu)化的提取條件進(jìn)行樣品前處理，并比較不同品種、不同產(chǎn)地甘草藥材中總黃酮和總皂苷的含量差異。

2.5 數(shù)據(jù)處理

用Excel、SPSS進(jìn)行數(shù)據(jù)計(jì)算和方差分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.1.1 黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線 測定結(jié)果計(jì)算后得回歸方程Y＝2.156 8X＋0.007 3，r＝0.999 7，線性范圍0.023～0.372mg，極差為0.349mg，符合線性要求，可用于樣品總黃酮含量計(jì)算。

3.1.2 皂苷標(biāo)準(zhǔn)曲線 測定結(jié)果計(jì)算后得回歸方程Y＝3.045 3X－0.038 6，r＝0.999 5，線性范圍0.032～0.399mg，極差為0.367mg，符合線性要求，可用于樣品總皂苷含量計(jì)算。

3.2 正交試驗(yàn)結(jié)果分析

對9組試驗(yàn)測得的甘草總黃酮和總皂苷含量進(jìn)行方差分析，篩選最佳工藝條件，結(jié)果見表2～4。

表2 甘草總黃酮和總皂苷成分提取工藝正交試驗(yàn)表

表3 總黃酮方差分析表

表4 總皂苷方差分析表

以甘草中總黃酮含量為指標(biāo)，對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，可得出各因素重要程度依次為B＞A＞D＞C，即固液比＞乙醇濃度＞超聲溫度＞氨水濃度，提取甘草中總黃酮的最優(yōu)條件為A3B3C3D2。以甘草中總皂苷的含量為指標(biāo)分析表明，最重要的因素是B，影響因素大小依次為B＞C＞D＞A，即固液比＞氨水含量＞超聲溫度＞乙醇濃度，提取總皂苷的最優(yōu)條件為A3B3C3D3。

分析結(jié)果顯示，各因素對兩成分提取率的影響主次不同，除固液比外，黃酮成分提取率主要受乙醇濃度的影響較大，氨水濃度在因素中的影響最小，但皂苷則受氨水濃度的影響較大，而乙醇濃度對其提取率的影響較小。

9組試驗(yàn)總黃酮和總皂苷含量比較見圖1。從圖1還可直觀地看出，在不同提取條件下，甘草總黃酮和總皂苷的含量差異較明顯，在試驗(yàn)3條件下，即A1B3C3D3，甘草皂苷的提取率達(dá)到最高，但甘草黃酮提取率不高，這是因受乙醇濃度的影響較大，高濃度的乙醇才有利于黃酮成分的溶出，綜合兩指標(biāo)，最佳工藝條件為A3B3C3D3，與第9次試驗(yàn)的A3B3C2D1接近，且從圖1中可看出，該工藝條件下，提取率幾乎達(dá)到最大值，若適當(dāng)增加固液比，甘草總黃酮和總皂苷的同時提取，完全可以兼顧。

圖1 9組試驗(yàn)總黃酮和總皂苷含量比較

A3B3C3D3不在安排的9組試驗(yàn)中，稱取同批試驗(yàn)樣品，進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，總黃酮和總皂苷的含量分別為50.19，59.78mg·g－1，驗(yàn)證結(jié)果與正交試驗(yàn)結(jié)果吻合，說明工藝穩(wěn)定可行，可用于同時測定甘草總黃酮和總皂苷含量時的樣品前處理。

3.3 不同品種和不同產(chǎn)地甘草藥材總黃酮和總皂苷含量比較

不同品種甘草藥材總黃酮含量測定結(jié)果見表5。

從表5可以看出，采集的7份不同品種甘草藥材總黃酮含量差異較大，方差分析表明其存在顯著差異，P＜0.05，以甘草的含量最低，脹果甘草含量最高。

不同產(chǎn)地甘草總黃酮和總皂苷含量測定結(jié)果見表6。

表5 不同品種甘草藥材總黃酮含量

表6 不同產(chǎn)地甘草藥材總黃酮和總皂苷含量

從表6數(shù)據(jù)分析可知，西北甘草總黃酮含量較低，而總皂苷含量卻較高，與中西部地區(qū)比較有顯著差異（P＜0.05）；但因樣本數(shù)量有限，分析結(jié)果僅供參考。

4 結(jié)論與討論

甘草黃酮和皂苷成分是甘草藥材中活性較強(qiáng)的兩類化合物［8］，因基本結(jié)構(gòu)不同，其理化性質(zhì)各異，在生產(chǎn)過程中分別進(jìn)行提取分離，則選擇性較好，但操作較繁瑣，需要的試劑和材料較多，往往造成資源的浪費(fèi)，若采取同時從藥材中提取分離的方法將會大大降低成本。鑒于此，本試驗(yàn)優(yōu)化了同時提取的工藝條件，為進(jìn)一步的分離及其含量測定提供參考。

甘草藥材來源復(fù)雜［9］，質(zhì)量參差不齊，這給處方用藥的質(zhì)量控制帶來了困難，要保證處方用藥的安全有效，需要找到能代表全面作用的靈敏指標(biāo)來控制，本試驗(yàn)比較了甘草總黃酮和總皂苷成分在不同品種和不同產(chǎn)地甘草藥材中的含量，結(jié)果有效反映了不同來源甘草藥材之間的質(zhì)量差異，檢測方法能很好地用于甘草藥材的質(zhì)量評價。

研究甘草總黃酮和總皂苷成分的提取工藝及其在不同來源甘草藥材中的含量差異，對合理有效地利用甘草，保證處方用藥的安全有效性等具有重要意義。

參考文獻(xiàn)

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［9］王文全，吳慶豐.我國的甘草資源與甘草栽培技術(shù)［J］.中藥研究與信息，2001，3（12）：18-20.

Study on the Extraction and Contents for Total Flavones and Saponins from Radix et Rhizoma Glycyrrhizae

Huang Mingjin1，Wang Wenquan1，2，Shen Shoumao1
（1.Chinese Pharmacy college，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing100102，China；2.The Engineering Research Center for Chinese Medicine Standardized Production of Educational Ministry，Beijing100102，China）

Objective：To optimize the extraction technology of total flavones and saponins from radix et rhizoma glycyrrhizae，and compare their difference in contents.MethodsThe total contents of flavonoids and saponins are determined by UV spectrophotometer，and orthogonal experiment is used for optimizing the extraction technology.ResultsThe optimal extraction technology should be A3B3C3D3，and there are obvious differences in the total contents of flavonoids and saponins among various areas.ConclusionThe extraction method is simple and realizable，and it is feasible to determine the contents of total flavonoids and saponins to control the herbs quality.

Radix et rhizoma glycyrrhizae；Flavonoids；Saponins；Rthogonal experiment；Contents

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（30572328）；高等學(xué)校博士點(diǎn)科研基金項(xiàng)目（20050026006）

*王文全，E-mail：wwq57＠126.com

2010-03-09）