許 勇，王 柯，季 申

（上海市食品藥品檢驗(yàn)所，上海 201203）

降脂靈是由三七、丹參、銀杏葉和燈盞花四味中藥提取物制成的膠囊劑。為上海上聯(lián)藥業(yè)有限公司和上海劍蘭生物制品有限公司生產(chǎn)的中藥制劑，原標(biāo)準(zhǔn)僅有檢查項(xiàng)，為控制藥品質(zhì)量，保證臨床用藥的安全性和有效性，我們建立了用薄層色譜方法鑒別本品中三七、丹參和銀杏葉三味藥材的方法，并采用高效液相色譜法對(duì)制劑中三七的活性成分三七皂苷R1和人參皂苷Rg1進(jìn)行了測(cè)定，建立的定性、定量方法均簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、專屬性強(qiáng)，可有效地控制本品的質(zhì)量。

1 儀器、試藥

Agilent 1100高效液相色譜儀，紫外-可見光檢測(cè)器，Chemstation色譜工作站。C18固相萃取小柱(35 mg，Waters公司)；銀杏葉對(duì)照藥材及人參皂苷Rb1、三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、隱丹參酮、丹參酮IIA對(duì)照品均由中國藥品生物制品檢定所提供。樣品:降脂靈膠囊樣品(批號(hào)為 090801、090701、090501)及陰性樣品均由上海上聯(lián)藥業(yè)有限公司和上海劍蘭生物制品有限公司提供。乙腈為色譜純(Merck公司)，其余試劑均為分析純由中國醫(yī)藥(集團(tuán))上海化學(xué)試劑公司提供。

2 薄層色譜鑒別

2.1 三七的薄層鑒別 取本品1粒的內(nèi)容物，加甲醇30 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。另取人參皂苷Rb1對(duì)照品、人參皂苷Rg1對(duì)照品及三七皂苷R1對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL各含2 mg的混合溶液，作為對(duì)照品溶液。取按處方除去三七的陰性樣品，同法制成陰性樣品溶液。吸取上述兩種溶液各1 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水(65∶35∶10)10℃以下放置的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%的硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。陰性樣品液無干擾，見圖1。

圖1 三七TLC圖譜

2.2 丹參的薄層鑒別 取本品5粒的內(nèi)容物，加乙醚30 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液揮至約1 mL，加于中性氧化鋁柱上(8 g，100～200目，內(nèi)徑15 mm)，以乙酸乙酯5 mL洗脫，收集洗脫液，作為供試品溶液。另取隱丹參酮對(duì)照品和丹參酮IIA對(duì)照品，加乙酸乙酯制成每1 mL各含2 mg的混合溶液，作為對(duì)照品溶液。再取按處方除去丹參的陰性樣品，同法制成陰性樣品溶液。吸取供試品溶液10～20 μL，對(duì)照品溶液3 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠 G 薄層板上，以環(huán)己烷-乙酸乙酯(17∶3)為展開劑，展開，取出，晾干。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。陰性樣品液無干擾，見圖2。

圖2 丹參TLC圖譜

2.3 銀杏葉的薄層鑒別 另取銀杏葉對(duì)照藥材1 g，加甲醇30 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為對(duì)照藥材溶液。吸取2.1項(xiàng)下的供試品溶液和銀杏葉對(duì)照藥材溶液各1 μL，再取按處方除去銀杏葉的陰性樣品，同法制成陰性樣品溶液。分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(5∶3∶1∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以1%的三氯化鋁乙醇溶液，熱風(fēng)吹干，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光主斑點(diǎn)。陰性樣品液無干擾，見圖3。

圖3 銀杏葉TLC圖譜

3 人參皂苷Rg1對(duì)照品和三七皂苷R1的含量測(cè)定

3.1 色譜條件 色譜柱:Thermo ODS-C18HYPERSIL(4.6 mm ×200 mm，5 μm)；流動(dòng)相:以乙腈為流動(dòng)相A，以水為流動(dòng)相B，按表1中的規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫；流速:1.0 mL/min；檢測(cè)波長:203 nm；柱溫:30℃；進(jìn)樣量:10 μL，理論板數(shù)按三七皂苷R1峰計(jì)算，不低于10000。結(jié)果樣品中人參皂苷Rg1對(duì)照品和三七皂苷R1與相鄰峰分離度大于1.8，陰性樣品溶液在與人參皂苷Rg1對(duì)照品和三七皂苷R1色譜峰相同位置處無干擾峰，表明樣品中其他成分對(duì)人參皂苷Rg1對(duì)照品和三七皂苷R1的測(cè)定無干擾，見圖4～6。

表1 梯度洗脫表

圖4 三七皂苷R1和人參皂苷Rg1對(duì)照品高效液相色譜圖

圖5 樣品高效液相色譜圖

3.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取人參皂苷Rg1對(duì)照品、三七皂苷R1對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL含人參皂苷Rg10.6 mg、三七皂苷R10.1 mg的混合溶液，即得。

圖6 陰性樣品高效液相色譜圖

3.3 供試品溶液的制備 取裝量差異項(xiàng)下的本品0.2 g，精密稱定，精密加入甲醇25 mL，稱定重量，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

3.4 陰性對(duì)照溶液的制備 取按處方除去三七的陰性樣品，按3.3項(xiàng)下的制備方法制成陰性對(duì)照溶液。

3.5 線性關(guān)系考察 精密稱取人參皂苷Rg1對(duì)照品、三七皂苷R1對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL含人參皂苷Rg11.062 mg、三七皂苷R13.602 mg的混合對(duì)照品貯備溶液，精密量取混合對(duì)照品貯備溶液1.0、2.5、5.0、10.0 mL，分別置 50 mL 量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，配成相應(yīng)質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液，分別將對(duì)照品貯備溶液和對(duì)照品溶液進(jìn)樣10 μL，記錄峰面積。以進(jìn)樣濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行分析，得回歸方程:三七皂苷 R1為:Y=2.98×103X+8.85，r=0.999(n=6)；人參皂苷 Rg1為 Y=2.22×103X－1.41，r=0.999(n=6)。結(jié)果表明，三七皂苷R1在0.02124～1.062 mg/mL范圍內(nèi)，進(jìn)樣濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系，人參皂苷Rg1在0.07204～3.602 mg/mL范圍內(nèi)，進(jìn)樣濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

3.6 精密度試驗(yàn) 精密吸取濃度分別為0.1054 mg/mL、0.9530 mg/mL的三七皂苷R1和人參皂苷Rg1對(duì)照品的混合溶液10 μL，按上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定，計(jì)算三七皂苷R1和人參皂苷Rg1峰面積的RSD分別為0.72%和0.11%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

3.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 吸取同一供試品溶液，在上述色譜條件下，分別于 0、3、8、14、20、34 h 進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果三七皂苷R1和人參皂苷Rg1峰面積的RSD分別為0.71%和0.41%。表明供試品溶液在34 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

3.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品6份，分別按3.3項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，三七皂苷R1和人參皂苷Rg1平均含量分別為4.96 mg/粒、29.7 mg/粒，RSD 分別為 0.61% 和1.7%。表明樣品重復(fù)性良好。

3.9 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的同一批樣品9份(1.534 mg/g)，分別加入三七皂苷R1和人參皂苷Rg1對(duì)照品適量，按供試品溶液方法制備供試液，測(cè)定，結(jié)果見表2，3。

3.10 樣品測(cè)定 按上述供試品溶液的制備方法和測(cè)定條件，測(cè)定3批樣品中三七皂苷R1和人參皂苷Rg1的含量，用外標(biāo)法計(jì)算，結(jié)果見表4，5。

4 討論

4.1 三七［1］10、銀杏葉［1］220藥材的薄層鑒別方法，收載于《中國藥典》2005年版一部，但復(fù)方制劑降脂靈膠囊中三七、銀杏葉的薄層鑒別方法尚未見報(bào)道。在進(jìn)行三七的薄層鑒別時(shí)，我們采用了甲醇超聲處理的方法，提取三七中的皂苷成分。結(jié)果方法簡(jiǎn)便、易行，且毒性較小并在薄層板上沒有雜質(zhì)干擾。并采用鑒別三七的供試品溶液同時(shí)對(duì)銀杏葉進(jìn)行有效鑒別，結(jié)果起到了一舉兩得的效果。

表2 三七皂苷R1加樣回收率試驗(yàn)

表3 人參皂苷Rg1加樣回收率試驗(yàn)

表4 樣品中三七皂苷R1測(cè)定結(jié)果

表5 樣品中人參皂苷Rg1測(cè)定結(jié)果

4.2 丹參藥材［1］52的薄層鑒別方法，收載于《中國藥典》2005年版一部，但采用薄層色譜法同時(shí)鑒別制劑降脂靈膠囊中隱丹參酮和丹參酮IIA的方法還尚未見報(bào)道。丹參的活性成分隱丹參酮和丹參酮IIA均為對(duì)熱不穩(wěn)定的化合物，為使其能有效的被提取出來，我們利用了隱丹參酮和丹參酮IIA可以被中性氧化鋁吸附，后被乙酸乙酯洗脫的性質(zhì)，有效、快捷地將其分離出來，最終在薄層色譜上沒有雜質(zhì)干擾。

4.3 檢測(cè)波長的確定 經(jīng)二極管陣列檢測(cè)器進(jìn)行紫外光譜掃描，樣品色譜圖中三七皂苷R1和人參皂苷Rg1色譜峰的紫外光譜與對(duì)照品一致，在203 nm處有最大吸收，故確定檢測(cè)波長為203 nm。

4.4 含量測(cè)定提取方法的選擇 三七皂苷R1和人參皂苷Rg1的含量測(cè)定方法文獻(xiàn)已報(bào)道的有高效液相色譜法［2-4］、薄層掃描法［5］，但復(fù)方制劑降脂靈膠囊中三七皂苷R1和人參皂苷Rg1的含量測(cè)定方法尚未見報(bào)道。在試驗(yàn)中采取回流提取、超聲提取等多種方法進(jìn)行了試驗(yàn)，結(jié)果超聲處理提取效率最高，故采用超聲處理的提取方式。同時(shí)我們對(duì)水、50%甲醇、甲醇、正丁醇4種提取溶劑進(jìn)行了考察，結(jié)果，水的提取效率最低，正丁醇次之，當(dāng)采用純甲醇進(jìn)行提取時(shí)，三七皂苷R1和人參皂苷Rg1的提取效率最高，故選擇用甲醇制備三七皂苷R1和人參皂苷Rg1對(duì)照品溶液和供試品溶液。

4.5 測(cè)定成分的選擇 三七藥材中的主要活性特征成分有三七皂苷 R1、人參皂苷 Rg1、人參皂苷Rb1，試驗(yàn)中曾經(jīng)摸索了同時(shí)測(cè)定3個(gè)主要活性成分的方法，但是因處方中的其它味藥材對(duì)人參皂苷Rb1的液相色譜有干擾，故最終選擇只測(cè)定三七皂苷R1和人參皂苷Rg1。另外，在試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，供試品色譜中有人參皂苷Re的存在，因其含量較低，故未對(duì)其進(jìn)行測(cè)定，但是也提示我們，本方法可以同時(shí)測(cè)定三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Re。因采用薄層掃描法測(cè)定人參皂苷，其三七皂苷R1和人參皂苷Re兩斑點(diǎn)很難分離，本實(shí)驗(yàn)方法能有效分離兩者，并同時(shí)測(cè)定三七中含量較高的指標(biāo)性成分三七皂苷R1和人參皂苷Rg1的含量，為控制含有三七藥材的產(chǎn)品質(zhì)量提供了新途徑。

［1］中國藥典［S］.一部.2005.

［2］林曉輝，張雪原，林史珍，等，高效液相色譜法測(cè)定心靈丸中三七皂苷 R1的含量［J］. 今日藥學(xué)，2009，19(1):44-45，27.

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